Isolamento di microparticelle derivate da linfociti T apoptotici in vitro

0 visualizzazioni3:50 min • July 8th, 2025

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Le microparticelle cellulari sono vescicole legate alla membrana di dimensioni submicroniche che racchiudono biomolecole rilasciate dalla membrana plasmatica di cellule eucariotiche in fase di apoptosi.

Per generare microparticelle derivate dai linfociti T, LMP in vitro, prelevare un pallone di coltura contenente coltura di linfociti T. Aggiungere actinomicina-D, un antibiotico. Incubare per una durata adeguata.

L'actinomicina-D entra nei linfociti e trasloca nel nucleo. Si intercala tra specifiche coppie di basi del DNA, inibendo la trascrizione. Questo porta all'arresto del ciclo cellulare e attiva la via apoptotica.

All'inizio dell'apoptosi, la caspasi-3 attivata si scinde e attiva la chinasi rho-associata, ROCK1. ROCK1, a sua volta, fosforila le sue proteine bersaglio a valle, causando la contrazione dell'actomiosina, che porta al blebbing della membrana e al successivo rilascio di LMP contenenti i componenti citosolici e nucleari nel mezzo.

Le cellule alla fine vanno incontro ad apoptosi.

Dopo l'incubazione, trasferire il terreno di coltura in una provetta nuova. Centrifuga per pellettare i linfociti T. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo.

Centrifugare per rimuovere i detriti di grandi cellule. Trasferire il surnatante contenente LMP in un flacone. Eseguire l'ultracentrifugazione ad alta velocità per pellettare gli LMP. Risospendere gli LMP in un tampone. Conservare a basse temperature fino a ulteriori analisi.

Per iniziare, coltivare le cellule T CEM in quattro fiasche T175, ciascuna contenente 150 millilitri di terreno fresco, e incubarle a 37 gradi Celsius fino a una densità di 2 milioni di cellule per millilitro.

Raccogliere le cellule da ciascun pallone mediante centrifugazione a 200 volte g per 5 minuti e risospendere 300 volte 10 a 6 celle in un nuovo pallone T175 contenente 150 millilitri di terreno fresco, per mantenere la densità di 2 milioni di cellule per millilitro. Aggiungere 37,5 microlitri di actinomicina D al terreno a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Trasferire tutto il terreno di coltura in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare le cellule a 750 volte g per 5 minuti. Quindi, trasferire il surnatante in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 1.500 volte g per 15 minuti per rimuovere i frammenti cellulari di grandi dimensioni.

Successivamente, trasferire il surnatante in un flacone da 250 millilitri e centrifugare a 12.000 volte g per 50 minuti. Quindi, scartare il surnatante e raccogliere i pellet. Utilizzare 40 millilitri di PBS sterile per lavare i pellet arricchiti con LMP in una provetta da 50 millilitri e centrifugare a 12.000 volte g per 50 minuti. Ripetere questo passaggio due volte.

Raccogliere il surnatante dall'ultimo lavaggio da utilizzare come controllo del veicolo, con 1 millilitro di PBS. Sospendere i pellet e trasferirli in una microprovetta sterile da 1,5 millilitri. Aliquotare e conservare le LMP isolate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

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Ultimo aggiornamento: 15 agosto 2026