Una tecnica in vitro per differenziare le cellule T helper produttrici di GM-CSF dalle cellule T naive

Fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, GM-CSF è secreto da cellule T helper produttrici di GM-CSF o cellule T_HGM. Queste cellule mostrano una bassa espressione di altre citochine specifiche delle cellule T helper.

Per iniziare la differenziazione in vitro delle cellule T_HGM, prendere una sospensione di cellule T helper - isolata dalla milza di topo - contenente cellule mature attivate dall'antigene e cellule naïve indifferenziate.

Aggiungere anticorpi marcati in fluorescenza che mirano ai marcatori caratteristici della superficie delle cellule naïve e mature. Eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per isolare le cellule T naive.

Placcare le cellule in un pozzetto rivestito con anticorpi che si legano al complesso del recettore delle cellule T. Aggiungere un anticorpo che si lega al recettore co-stimolatorio. Il legame sinergico attiva le cellule.

Aggiungere l'interleuchina 7 – una citochina – che induce la differenziazione nelle cellule T_HGM e la produzione di GM-CSF. Aggiungi il forbolo miristato acetato, PMA - un composto pro-infiammatorio, ionomicina - uno ionoforo di calcio e un inibitore del trasporto proteico.

La PMA entra nella cellula e attiva una proteina chinasi. La ionomicina permeabile alla membrana trasloca gli ioni calcio all'interno della cellula, aumentando la concentrazione intracellulare di calcio.

L'attivazione della proteina chinasi e un alto livello di calcio avviano segnali che restimolano le cellule_T.H.GM., con conseguente aumento della produzione di GM-CSF. L'inibitore del trasporto proteico blocca la secrezione di GM-CSF, favorendo il rilevamento intracellulare.

Eseguire la colorazione in immunofluorescenza, rilevare le citochine intracellulari e analizzare le cellule utilizzando la citometria a flusso. La maggior parte delle cellule che mostrano alti livelli di GM-CSF ma una bassa espressione di altre citochine indicano una differenziazione di successo in cellule T_HGM.

Per isolare le cellule T CD4-positive, risospendere il pellet di globuli bianchi in 5 millilitri di tampone di isolamento cellulare e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 30 micrometri in un nuovo tubo da 15 millilitri per rimuovere eventuali detriti. Dopo il conteggio, risospendere le cellule a una concentrazione di 1 x 10⁷ cellule per 90 microlitri di tampone e aggiungere 10 microlitri di perle magnetiche coniugate anti-CD4 per 1 x 10⁷ cellule per un'incubazione di 15 minuti a 4 gradi Celsius, mescolando ogni 5 minuti.

Durante l'incubazione delle cellule, posizionare una colonna di separazione su un supporto magnetico e pre-bagnare la colonna con 2 millilitri di tampone. Quindi, lavare le celle con 5 millilitri di tampone e risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone. Caricare il campione sulla colonna e raccogliere la frazione CD4-negativa in una provetta conica da 15 millilitri.

Quando tutte le cellule sono passate attraverso la colonna, lavare il serbatoio tre volte con 1 millilitro di tampone per lavaggio prima che si asciughi. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in una nuova provetta conica da 15 millilitri e immergere la colonna con 2 millilitri di tampone di isolamento cellulare per espellere la frazione positiva della microsfera. Quindi, raccogliere le cellule CD4-positive mediante centrifugazione.

Per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza delle cellule T naive, risospendere il pellet di cellule CD4-positive selezionate con microsfere in 500 microlitri di tampone e mescolare le cellule con un appropriato cocktail di anticorpi coniugati a fluorescenza. Dopo 20-30 minuti in ghiaccio, al riparo dalla luce, lavare le celle in 5 millilitri di tampone fresco, e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fresco.

Filtrare le cellule attraverso una rete di nylon e trasferire le cellule in una provetta FACS precodificata con 500 microlitri di tampone. Gate per selezionare le popolazioni cellulari CD4-positive, CD25-negative e CD44 a basso ligando CD62 alto. Quindi, smistare le frazioni di cellule T CD4-positive, CD25-negative, CD-44 basse, CD-62 alte in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri e pellettare le cellule T CD4-positive naive isolate mediante centrifugazione.

Per il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, o GM-CSF, la differenziazione delle cellule T helper, risospendere le cellule T selezionate a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule per millilitro in un terreno RPMI completo contenente 50 micromolari beta-mercaptoetanolo e aspirare l'anticorpo epsilon anti-CD3 da ciascun pozzetto di una piastra precodificata a 48 pozzetti.

Quindi, seminare 2,5 x 10⁵ cellule in ciascun pozzetto insieme a IL-7, anti-CD28 e anti-IFN gamma e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂ per tre giorni. Il terzo giorno di coltura, utilizzare un microscopio per controllare la differenziazione cellulare e raccogliere le cellule per la centrifugazione.

Risospendere il pellet in terreno RPMI completo fresco per due lavaggi, risospendendo le celle in 1 millilitro di terreno completo fresco dopo il secondo lavaggio per il conteggio. Dividere le cellule in tre volumi uguali e stimolare nuovamente la prima aliquota di cellule con PMA e ionomicina in presenza di un inibitore del trasporto proteico per 4-6 ore.

Al termine della stimolazione, raccogliere le cellule per la colorazione con anticorpo anti-CD4. Dopo 30 minuti, fissare le cellule con 200 microlitri di tampone di fissazione per 20-60 minuti, seguiti da due lavaggi in 1 millilitro di tampone di permeabilizzazione per lavaggio. Quindi, colorare per l'espressione delle citochine intracellulari per 30 minuti al buio.