Introduzione di proteine effettrici batteriche nelle cellule di mammifero mediante elettroporazione

Alcuni patogeni batterici gram-negativi entrano in contatto con le cellule ospiti e impiegano sistemi di secrezione per iniettare proteine effettrici, facilitando l'invasione cellulare.

Per somministrare proteine effettrici in cellule di mammifero in vitro, pipettare le cellule di mammifero in una cuvetta refrigerata. Aggiungere proteine effettrici batteriche marcate con peptidi leganti la streptavidina e mescolare.

Eseguire l'elettroporazione. Durante la corsa, brevi impulsi elettrici interrompono il doppio strato lipidico della membrana della cellula ospite per formare pori transitori, facilitando l'ingresso cellulare delle proteine effettrici. Placcare le cellule su una lastra di vetro contenente un terreno, in modo che le cellule si riprendano e aderiscano alla piastra. I pori si richiudono, intrappolando le proteine all'interno.

Dopo il recupero cellulare, fissare e permeabilizzare le cellule per l'accesso degli anticorpi ai bersagli intracellulari. Incubare con una soluzione bloccante contenente proteine per prevenire il legame di anticorpi non specifici. Aggiungere anticorpi primari che si legano specificamente al tag peptidico legante la streptavidina sulle proteine effettr