Un modello di infezione da macrofagi completamente differenziato di cellule derivate da monociti con Mycobacterium tuberculosis

Ottenere una coltura di macrofagi completamente differenziati in una piastra a più pozzetti. Questi macrofagi hanno marcatori di superficie, come i recettori toll-like o TLR-2, un recettore di riconoscimento dei modelli che identifica vari componenti microbici.

Aggiungere una quantità appropriata di Mycobacterium tuberculosis marcato in fluorescenza o sospensione cellulare di Mtb in ciascun pozzetto e incubare.

Il TLR-2 riconosce il lipoarabinomannano, o LAM, un componente glicolipidico complesso della parete cellulare di Mtb, avviando la fagocitosi. Il macrofago internalizza Mtb, sequestrando il batterio all'interno di un fagosoma, un compartimento legato alla membrana.

Il fagosoma matura, fondendosi con i lisosomi, formando un fagolisoma, un compartimento acido e ricco di enzimi.

All'interno del fagolisosoma, la Mtb inibisce la pompa protonica di tipo vacuolare responsabile della generazione di un pH acido. Di conseguenza, il pH all'interno del fagolisosoma diventa quasi neutro, disattivando gli enzimi che degradano i patogeni inghiottiti.

L'interazione tra LAM e TLR2, influenza anche le vie di segnalazione della cellula ospite, portando alla modulazione dei marcatori di superficie coinvolti nella presentazione dell'antigene.

L'inattivazione del fagolisosoma e l'inibizione della risposta immunitaria dell'ospite consentono a Mtb di persistere e replicarsi all'interno del macrofago.

Per infettare le cellule derivate dai monociti, diluire i batteri a una concentrazione di 5 volte 10 fino alla sesta unità formante colonie per millilitro in terreno privo di siero e sostituire il surnatante in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare a sei pozzetti, con 1 millilitro di terreno fresco privo di siero e 1 millilitro di sospensione batterica per pozzetto per ottenere una molteplicità di infezione di 5.

Dopo un'incubazione di 4 ore nell'incubatore per colture cellulari, lavare ogni pozzetto tre volte con 1 millilitro di tampone di lavaggio sterile per lavaggio, inclinando accuratamente la piastra per rimuovere l'intero volume di tampone dagli angoli dei pozzetti dopo ogni lavaggio. Quindi, risospendere le cellule derivate dai monociti infettate da MTb in 2 millilitri di terreno completo senza antibiotici.