Determinazione del ruolo della vitronectina nella resistenza batterica all'attività battericida del siero umano

Per studiare l'impatto della vitronectina, una glicoproteina sierica umana, sui batteri, iniziare con provette contenenti la sospensione di Haemophilus influenzae.

Trattare una provetta con normale siero umano contenente vitronectina e l'altra con siero impoverito di vitronectina. Entrambe le varianti di siero contengono anticorpi e varie proteine del complemento, essenziali per l'attività battericida.

Durante l'incubazione, gli anticorpi interagiscono con le proteine di superficie batteriche, attivando le proteine del complemento per formare la C5 convertasi, che scinde il C5. C5b si associa a C6, seguito da C7, formando il complesso C5b6-7. Questo complesso si lega alla membrana cellulare batterica e recluta C8, formando C5b67-8.

Questo processo facilita l'adesione dei monomeri C9 e la loro polimerizzazione, generando il complesso di attacco alla membrana, una struttura che forma i pori. Questi pori causano l'afflusso di ioni e acqua, portando alla lisi batterica.

Al contrario, nella provetta con siero normale, la vitronectina si lega a una proteina di superficie batterica che interagisce con il complesso C5b6-7 e i monomeri C9. Queste interazioni impediscono il reclutamento di C8 e la polimerizzazione di C9, inibendo la formazione di complessi di attacco alla membrana e portando alla sopravvivenza batterica.

Prelevare la sospensione batterica sia dalle provette che dalla coltura su piastre di agar individuali.

Le colonie batteriche più elevate nel siero contenente vitronectina confermano il suo ruolo nella resistenza batterica contro l'attività battericida del siero umano.

Per eseguire l'analisi della resistenza vitronectina-dipendente all'attività battericida del siero umano, in primo luogo, coltivare e pellettare i batteri come descritto nel protocollo di testo. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet batterico con 1 volume di tampone veronale di gelatina di destrosio. A questo punto si aggiungono 1.500 CFU di batteri a 100 microlitri di DGVB++ contenente il 5% di siero.

Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti agitando a 300 giri/min. Rimuovere un'aliquota di 10 microlitri dalla miscela di reazione a 0 minuti e 15 minuti. Metti l'aliquota sull'agar di cioccolato e incuba la piastra a 37 gradi Celsius per una notte. Dopo l'incubazione delle piastre di agar al cioccolato, contare le colonie che appaiono sulla piastra e calcolare la percentuale di batteri uccisi come descritto nel protocollo di testo.