JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
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Iniziare con una coltura scongelata di Mycobacterium bovis BCG lux, un ceppo bioluminescente geneticamente modificato di Mycobacterium bovis attenuato che esprime l'enzima luciferasi reporter.
Inoculare la sospensione in un pallone di coltura contenente il terreno di coltura antibiotico integrato con igromicina. Incubare. BCG lux ospita il gene resistente all'igromicina, facilitandone la sopravvivenza e la crescita.
Dopo l'incubazione, preparare le diluizioni di coltura appropriate utilizzando un tampone in provette luminometriche. Trasferire sul luminometro, caricato con una soluzione di substrato di aldeide alifatica a catena lunga. Durante la corsa, l'aldeide viene iniettata nella sospensione micobatterica che entra nelle cellule.
La luciferasi batterica catalizza l'ossidazione del mononucleotide endogeno ridotto di flavina e dell'aldeide, con conseguente emissione di luce blu-verde. L'intensità di bioluminescenza misurata indica l'attività metabolica del flusso BCG ed è correlata alla misura dei batteri vitali o delle unità formanti colonie, CFU.
Quindi, centrifugare la coltura micobatterica rimanente. Risospendere il pellet micobatterico in un tampone contenente un tensioattiv
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