Una tecnica per stabilire un modello di infezione batterica nelle larve di insetti

Posizionare una larva di Galleria mellonella - la falena della cera maggiore - su una piattaforma di iniezione, esponendo il lato ventrale.

Prendi una microsiringa contenente una sospensione di Mycobacterium bovis BCG lux, un ceppo di vaccino batterico vivo geneticamente modificato per produrre bioluminescenza. Iniettare la sospensione nell'ultima gamba o nelle appendici addominali, rilasciando batteri nell'emolinfa, nel liquido circolatorio nella cavità del corpo.

Trasferire la larva in un ambiente controllato e incubarla. I batteri utilizzano l'emolinfa come ricca fonte di sostanze nutritive e si moltiplicano.

Gli emociti, le cellule immunitarie invertebrate nell'emolinfa, si raggruppano attorno ai batteri, formando una struttura simile a un granuloma per prevenire la diffusione dell'infezione. Gli emociti rilasciano pro-fenoliossidasi, che subisce una scissione proteolitica per formare fenolidossidasi.

La

fenolidasi sintetizza la melanina, che sequestra i batteri nel sito di infezione. La deposizione di pigmento di melanina provoca melanizzazione sistemica, scurimento del colore larvale.

Gli emociti inghiottono i batteri nei fagosomi. I fagosomi si fondono con i lisosomi per acquisire enzimi litici, causando la degradazione batterica. Un sottogruppo di batteri può eludere la degradazione fagolisosomiale e risiedere negli emociti, portando a un'infezione persistente.

Misurare la bioluminescenza batterica a intervalli definiti. Un calo iniziale della bioluminescenza indica un'efficace risposta antibatterica, mentre un plateau del valore indica un'infezione persistente.

Mantenere le larve di stadio acquistate al buio a 18 gradi Celsius all'arrivo e utilizzarle entro una settimana dall'acquisto. Identificare e selezionare larve sane per la sperimentazione in base al colore crema uniforme, alle dimensioni e al peso appropriati, all'elevata motilità e al possesso della capacità di raddrizzarsi quando vengono girate. Usando una pinzetta smussata, conta attentamente le larve sane in una capsula di Petri foderata con uno strato di carta da filtro e conservale a temperatura ambiente al buio fino al momento dell'uso.

Preparare la piattaforma di iniezione fissando con nastro adesivo una carta da filtro circolare di 94 millimetri di diametro su una superficie piana e rialzata. Aspirare tre volumi di etanolo al 70% in una microsiringa da 25 microlitri per sterilizzare, scartare e risciacquare ulteriormente con tre volumi di PBST sterile. Quindi, risospendere l'inoculo BCG lux preparato e aspirare 10 microlitri nella microsiringa sterilizzata. Utilizzare una siringa separata per aspirare PBST per un controllo negativo.

Dopo 10 iniezioni, risospendere l'inoculo BCG lux per garantire una sospensione cellulare uniforme. Usa le pinzette per raccogliere una larva e posizionarla sulla piattaforma di iniezione. Sulla piattaforma, capovolgi la larva sulla schiena e immobilizzala fissando la testa e la coda con le pinzette. Individuare l'ultima proleg sinistra con il conto alla rovescia dalla testa della larva e inserire con cautela la punta dell'ago a 5-6 mm di profondità con un angolo di 10-20 gradi rispetto al piano orizzontale. Iniettare l'inoculo dalla siringa.

Dopo ogni infezione, trasferire la larva infetta in una capsula di Petri rivestita con uno strato di carta da filtro. Una singola capsula di Petri da 94 millimetri può ospitare fino a 30 larve. Conservare la capsula di Petri in una scatola scura ventilata all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Monitorare la sopravvivenza delle larve ogni 24 ore. Le larve sono considerate morte quando non riescono a muoversi in risposta al tatto. Registrare la sopravvivenza e valutare la significatività statistica con un test di Mantel-Cox.