JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:41 min • July 8th, 2025
Posizionare un mouse anestetizzato sul cuscinetto chirurgico sterile collegato a un'unità di respirazione con un flusso continuo di ossigeno e un gas anestetico.
Utilizzando un filtro, caricare la siringa con aria sterile. Collegare un ago alla siringa e iniettare aria sterilizzata per via sottocutanea nella parte posteriore del topo per creare una sacca d'aria all'interno degli strati di tessuto. Monitorare il mouse fino al ripristino.
Anestetizzare nuovamente il topo e somministrare il lipopolisaccaride, LPS, nella sacca d'aria. LPS si lega al recettore toll-like 4, TLR-4 sui macrofagi residenti nei tessuti e sulle cellule dendritiche, attivandoli.
Le cellule attivate rilasciano vari mediatori infiammatori come citochine e chemochine, che attirano i neutrofili e altre cellule immunitarie. Questi mediatori aumentano anche la permeabilità vascolare dei vasi sanguigni vicini, consentendo alle cellule immunitarie e ai fattori solubili di entrare nella sacca d'aria dal flusso sanguigno.
Quando il liquido si accumula all'interno della sacca, forma un essudato che comprende cellule infiammatorie e varie molecole bioattive.
Sopprimere il topo e iniettare un tampone di lavaggio adatto nella sacca d'aria. Raccogliere l'essudato infiammatorio in una provetta da microcentrifuga e centrifugare. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel tampone di lavaggio.
Analizzare l'essudato infiammatorio per quantificare il rapporto dei neutrofili e determinare l'entità della loro infiltrazione.
Dopo l'anestesia dei topi il giorno zero, utilizzare un filtro da 0,22 micron collegato a una siringa da cinque millilitri per ottenere un volume di tre millilitri di aria sterilizzata. Sollevare la pelle posteriore del topo anestetizzato con una pinzetta e utilizzare per via sottocutanea un ago calibro 26 da 3/8 di pollice per iniettare tre millilitri di aria sterilizzata.
Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità di respirazione e metterli in una gabbia ben posizionata. Monitora i topi per assicurarti che siano vivi fino a quando non iniziano a muoversi. Il terzo giorno, iniettare altri tre millilitri di aria sterilizzata nella sacca d'aria precedentemente stabilita per sostenere la sacca d'aria.
Il sesto giorno, iniettare diversi trattamenti nella sacca d'aria. Iniettare un millilitro di PBS come controllo negativo e iniettare un millilitro di un microgrammo per millilitro di LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale. Dopo sei ore, sacrifica i topi.
Per ogni sacca d'aria, iniettare un millilitro di tampone di lavaggio per lavare la sacca d'aria e raccogliere l'essudato infiammatorio in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi, lavare due volte la sacca d'aria con due millilitri di tampone di lavaggio e raccogliere l'essudato infiammatorio nella stessa provetta da centrifuga.
Centrifugare a 100 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio. Contare le cellule per quantificare il rapporto dei neutrofili, utilizzando l'analizzatore ematologico automatico.