Quantificazione dell'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto vescicale di topo uropatogeno infetto da E. coli mediante citometria a flusso

0 views • 3:43 min • July 8th, 2025

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Per quantificare l'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto vescicale di topo infetto da E. coli uropatogeno, porre il tessuto tritato in un tampone di digestione contenente collagenasi e desossiribonucleasi.

Incubare agitando regolarmente per rompere il tessuto.

La collagenasi digerisce la matrice extracellulare del tessuto, rilasciando le cellule. La desossiribonucleasi degrada il DNA libero interferente.

Dopo l'incubazione, aggiungere un tampone con un agente chelante e siero fetale bovino per inattivare gli enzimi digestivi.

Passare la miscela digerita attraverso un colino per rimuovere i detriti tissutali e il tessuto connettivo, ottenendo una sospensione unicellulare.

Centrifugare e risospendere le cellule in un tampone contenente anticorpi bloccanti Fc. Questi anticorpi si legano ai recettori Fc delle cellule immunitarie per prevenire il legame degli anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi anti-CD45 marcati con fluorofori, che si legano alla proteina CD45 transmembrana sulle cellule immunitarie.

Centrifugare e far passare le cellule risospese attraverso un colino cellulare per rimuovere gli aggregati cellulari.

Utilizzando un citometro a flusso, misurare i segnali di fluorescenza degli anticorpi coniugati con fluorofori sulle cellule immunitarie per quantificare l'infiltrazione delle cellule immunitarie nella vescica.

Per eseguire la citometria a flusso sul tessuto vescicale, dopo aver isolato la vescica come dimostrato, utilizzare le forbici per tritare bene il tessuto. Aggiungere 1 vescica tritata per ogni tubo contenente il tampone di digestione, quindi agitare il tubo per lavare il tessuto tritato nel tampone di digestione e tenerlo in ghiaccio fino a quando tutte le vesciche non sono state sezionate e tritate. Incubare le vesciche tritate a 37 gradi Celsius per 60-75 minuti agitando vigorosamente a mano per 5 secondi ogni 15 minuti.

Quando il fazzoletto ha un aspetto vetroso e trasparente simile alla carta velina bagnata, la digestione è completa. Inattivare gli enzimi della digestione aggiungendo da 2 a 3 millilitri di tampone per citometria a flusso ghiacciato e mescolare delicatamente. Quindi, posizionare i tubi sul ghiaccio.

Per garantire una sospensione unicellulare e per rimuovere l'eventuale tessuto connettivo, far passare il contenuto della provetta attraverso un filtro da 100 micrometri posto in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, con l'estremità di uno stantuffo della siringa, premere delicatamente il tessuto rimanente attraverso il filtro. Lavare il filtro con altri 2 millilitri di tampone per citometria a flusso e mantenere i campioni in ghiaccio. Quindi, lavare i campioni mediante centrifugazione a 200 volte g a 4 gradi Celsius per 7 minuti.

Risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone per citometria a flusso contenente blocco Fc diluito a 5 microgrammi per millilitro e trasferire in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Dopo 10-15 minuti, aggiungere 100 microlitri del cocktail di anticorpi desiderato a ciascun campione. Quindi, incubare i campioni su ghiaccio, al riparo dalla luce, per 30-45 minuti. Lavare i campioni mediante centrifugazione a 200 volte g a 4 gradi Celsius per 7 minuti.

Infine, risospendere i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone per citometria a flusso e far passare i campioni attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri su una provetta di polistirene da 5 millilitri appena prima dell'acquisizione su un citometro a flusso.

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Last updated: 18 July 2026