JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:33 min • July 8th, 2025
Prendete una coltura di organoidi intestinali umani. Gli organoidi sono costituiti da cellule epiteliali rivolte verso il lume centrale, imitando l'architettura in vivo.
Prendi un microiniettore contenente sporozoiti a forma di mezzaluna – la forma infettiva – di Cryptosporidium parvum, un parassita.
Iniettare sporozoiti nel lume dell'organoide.
Le lectine dei parassiti si legano a specifici carboidrati sulle cellule epiteliali, facilitando il loro ingresso in un vacuolo parassitoforo.
Il parassita internalizzato si trasforma in un trofozoite – la fase di alimentazione – che acquisisce sostanze nutritive e subisce una riproduzione asessuata per formare meront di tipo I, contenente merozoiti – la forma invasiva.
I merozoiti rilasciati infettano le cellule epiteliali vicine e sviluppano meronti di tipo II contenenti merozoiti.
I merozoiti entrano nelle cellule vicine e si differenziano in microgamont o macrogamont, stadi riproduttivi maschili e femminili.
Il microgamont subisce una divisione per formare microgameti, che vengono rilasciati al di fuori del vacuolo.
Un microgamete feconda il macrogamont, producendo uno zigote.
Lo zigote subisce una divisione, formando un'oocisti contenente sporozoite. Al momento del rilascio, gli sporozoiti ripetono il ciclo di infezione.
Raccogli gli organoidi per valutare l'andamento dell'infezione.
Per microiniettare i parassiti nel lato apicale di un organoide 3D, in primo luogo, utilizzare un estrattore per micropipette per preparare i capillari di iniezione in vetro. Usa una pinza per tagliare la punta del capillare a un diametro da 9 a 12 micrometri, per consentire un facile flusso di sporozoiti o oocisti se scegli di iniettare direttamente le oocisti, e usa le punte del micro-caricatore per riempire ogni capillare con una sospensione di oocisti o sporozoite marcata con colorante verde veloce.
Quindi, caricare il primo capillare pieno di sporozoite in un microiniettore e utilizzare un microscopio invertito a un ingrandimento 5x e una pressione costante per microiniettare da 100 a 200 nanolitri di sospensione in ciascun organoide.