Un sistema reporter di virus ricombinante in vitro per il rilevamento di infezioni virali
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:56 min • July 8th, 2025
Prendiamo una coltura di cellule di cancro al fegato umano, geneticamente modificata per esprimere il polipeptide co-trasportatore del taurocolato di sodio o NTCP, un recettore transmembrana.
Aggiungere il virus dell'epatite B ricombinante, o HBV. Il virus comprende un involucro esterno contenente proteine di superficie e un nucleocapside interno che racchiude il genoma. L'inserimento di un gene reporter della luciferasi inibisce la capacità riproduttiva del virus.
La proteina dell'involucro virale si lega al recettore NTCP della cellula ospite.
NTCP interagisce con il recettore del fattore di crescita epidermico, EGFR, e oligomerizza, inducendo l'endocitosi del virus mediata da EGFR.
L'involucro virale si fonde con la membrana dell'endosoma per rilasciare il nucleocapside, che si disassembla nel complesso dei pori nucleari.
Il genoma virale entra nel nucleo e si converte in DNA circolare chiuso covalentemente o cccDNA – un modello stabile – che codifica per le proteine virali, inclusa la luciferasi.
A intervalli predefiniti, raccogliere le cellule e lisarle per rilasciare la luciferasi intracellulare.
Introduci un substrato reporter. La luciferasi ossida il substrato, producendo un segnale.
Un aumento post-infezione dell'attività della luciferasi indica un'espressione continua del genoma virale.
Piastre di cellule HepG2, che esprimono stabilmente taurocolato di sodio, polipeptide co-trasportatore o NTCP che sono suscettibili all'infezione da HBV e incubano a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.
Un giorno prima dell'infezione, preparare circa 5 x 104 cellule HepG2/NTCP nei pozzetti di una piastra rivestita di collagene a 96 pozzetti in 0,1 millilitri di terreno di coltura. Scongelare l'HPV ricombinante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, fino a quando non rimane un po' di ghiaccio nella fiala.
Preparare il terreno per l'infezione combinando 78 microlitri di terreno di coltura fresco, due microlitri di DMSO, 10 microlitri di PEG8000 al 40% in 1X PBS e 10 microlitri di HPV ricombinante. Aggiungere 100 microlitri di soluzione ricombinante di HBV a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Un giorno dopo l'infezione, utilizzare 300 microlitri di PBS per lavare la cellula tre volte, per rimuovere la proteina reporter contaminante dalla frazione virale. Aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura contenente il 2% di DMSO alle cellule infette e incubare per una settimana o meno.
Per effettuare l'analisi dell'infezione da HBV, una settimana dopo l'infezione, utilizzare il PBS per lavare le cellule infette tre volte. Aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi alle cellule infette. Agitare la piastra di coltura per cinque minuti, quindi centrifugare a 2000 volte g per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri del substrato reporter a una piastra luminometrica, quindi aggiungere 20 microlitri di lisato cellulare alla piastra e mescolare agitando brevemente. Infine, posiziona la lastra nel luminometro e avvia la lettura.
Panoramica
Questo studio analizza il meccanismo di infezione del virus dell'epatite B (HBV) in cellule di carcinoma epatico umano modificate geneticamente per esprimere il polipeptide di co-trasporto del taurocolato sodico (NTCP). La ricerca evidenzia il ruolo di NTCP nel facilitare l'ingresso dell'HBV e l'espressione successiva delle proteine virali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Biologia cellulare
- Ematologia
Sfondo
- Il virus dell'epatite B è un problema significativo per la salute globale.
- NTCP è un recettore che media l'ingresso del virus dell'epatite B nelle cellule epatiche.
- Comprendere i meccanismi di infezione del virus dell'epatite B può contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche.
- Il saggio con il reporter luciferasi viene utilizzato per misurare l'attività virale.
Scopo dello studio
- Chiarire il ruolo del NTCP nell'infezione da HBV.
- Valutare l'espressione del genoma virale dopo l'infezione.
- Sviluppare un metodo affidabile per lo studio dell'HBV in vitro.
Metodi Utilizzati
- Coltura di cellule HepG2 che esprimono NTCP.
- Infezione con HBV ricombinante contenente un gene reporter della luciferasi.
- Lisi cellulare e misurazione dell'attività della luciferasi.
- Utilizzo di PBS e buffer di lisi per l'elaborazione delle cellule.
Risultati principali
- Infezione riuscita delle cellule HepG2/NTCP da parte del virus dell'epatite B (HBV).
- L'aumento dell'attività della luciferasi indica un'espressione in corso del genoma virale.
- L'interazione di NTCP con HBV facilita l'ingresso del virus nelle cellule ospiti.
- I saggi della luciferasi forniscono una misura quantitativa dell'infezione da HBV.
Conclusioni
- NTCP è essenziale per l'ingresso dell'HBV nelle cellule epatiche.
- I saggi con reporter luciferasi sono efficaci per lo studio della dinamica dell'HBV.
- Questo modello può essere utilizzato per future ricerche sull'HBV e per la sperimentazione di farmaci.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento quantitativo dell'infezione da virus dell'epatite B (HBV) mediante un sistema riportatore ricombinante della luciferasi consente una misurazione precisa degli eventi iniziali di entrata virale e replicazione nelle cellule epatiche umane. Questa capacità sostiene una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi e nella riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi di scoperta di antivirali. Il sistema fornisce una piattaforma scalabile e riproducibile per valutare le interazioni tra HBV e l'ospite e per lo screening di interventi candidati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette un'analisi diretta dei meccanismi di ingresso dell'HBV attraverso il legame con il recettore NTCP.
- Consente la validazione funzionale delle interazioni ospite-virus fondamentali per il targeting terapeutico.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico isolando gli eventi iniziali dell'infezione dalla replicazione successiva.
- Fornisce letture quantitative per la priorizzazione degli obiettivi guidata da ipotesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio cellulare validato e riproducibile per il rilevamento dell'infezione da HBV.
- Genera segnali robusti e quantitativi di luciferasi adatti per lo screening ad alto rendimento.
- Standardizza la misurazione dell'infezione, consentendo una valutazione affidabile dei composti e la trasferibilità del saggio.
- Supporta la scalabilità per lo screening di librerie mirate all'ingresso o alla replicazione virale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le dinamiche di infezione in vitro a modelli di cellule ospiti rilevanti per la malattia.
- Permette una continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica di candidati antivirali.
- Fornisce una piattaforma per la valutazione di biomarcatori traslazionali dell'infezione da HBV quando supportata da endpoint aggiuntivi.
- Riduce il rischio biologico chiarificando le interazioni precoci tra virus e ospite.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema di reporter virale ricombinante si inserisce nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, supportando sia studi meccanicistici sia flussi di lavoro di screening nella ricerca sull'HBV.
- Biologia della scoperta: Quantifica l'ingresso virale e la replicazione iniziale, chiarificando i percorsi di infezione mediati da NTCP.
- Screening: Fornisce letture standardizzate e riproducibili basate sulla luciferasi per la valutazione di composti.
- Analisi: Permette misurazioni sensibili e quantitative della cinetica di infezione e del confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità preclinica modellando l'infezione in cellule epatiche di origine umana.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e adattabile per esigenze diversificate di ricerca sull'HBV e screening di antivirali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella comprensione meccanicistica dell'infezione da HBV.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi per i team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei portafogli di antivirali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione corretta per rischio delle risorse mirate all'HBV e la progressione dei candidati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella manipolazione di virus e nei saggi basati sulla luminescenza.
- Necessita dell'accesso a cellule HepG2 che esprimono NTCP e a un virus reporter ricombinante dell'HBV.
- Richiede strumentazione standardizzata per il rilevamento del segnale di luciferasi e l'analisi dei dati.
- Un allineamento tra gruppi di lavoro sui protocolli del saggio e sull'interpretazione dei dati è essenziale per la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri sistemi virali potrebbe richiedere ulteriore validazione e ottimizzazione.
Domande frequenti di biotecnologie farmaceutiche
Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus
Video correlati
0 Visualizzazioni
Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale
Video correlati
0 Visualizzazioni
Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika
Video correlati
0 Visualizzazioni
A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione
Video correlati
0 Visualizzazioni
Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay
Video correlati
0 Visualizzazioni
Un virus dell'influenza reporter fluorescente luciferasi per tracciare le infezioni virali
Video correlati
0 Visualizzazioni
Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica
Video correlati
0 Visualizzazioni
All'inizio virali ingresso saggi per l'identificazione e la valutazione di composti antivirali
Video correlati
0 Visualizzazioni
Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione
Video correlati
0 Visualizzazioni
Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro e In Vivo utilizzando un sistema di Reporter dell'Adenovirus
Video correlati
0 Visualizzazioni
Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026