Instillazione intrabronchiale di Streptococcus pneumoniae in modelli di roditori immunocompetenti

Procurarsi un dispositivo di intubazione sterile costituito da una cannula metallica con tubo in polietilene collegata a un ago metallico.

Collegare una siringa contenente Streptococcus pneumoniae all'ago e riempire il tubo.

Quindi, posizionare un ratto immunocompetente anestetizzato in posizione supina.

Inserire l'estremità libera della cannula metallica nella bocca del topo. Avanzalo nella trachea verso il bronco sinistro e lungo il polmone sinistro fino a una profondità appropriata.

Far avanzare il tubo fino all'estremità della cannula e instillare la sospensione batterica nel lobo polmonare sinistro.

La capsula batterica e gli enzimi associati alla superficie prevengono l'intrappolamento batterico nel muco. Inoltre, lo Streptococcus pneumoniae si lega ai recettori di superficie delle cellule epiteliali bronchiali, facilitando l'endocitosi e il rilascio sulla superficie basolaterale.

I batteri secernono tossine che danneggiano le cellule epiteliali e le barriere, innescando una risposta immunitaria.

Tuttavia, lo Streptococcus pneumoniae ha sviluppato strategie per eludere la risposta immunitaria dell'ospite e stabilire l'infezione polmonare.

Posizionare un tappetino usa e getta pulito sul piano di lavoro, vicino al bagnomaria.

Per preparare il piano di lavoro e il dispositivo di intubazione, sterilizzare prima la cannula metallica e il tubo in polietilene secondo il protocollo di testo, quindi trasferirlo nel suo tubo di vetro sul piano di lavoro. Quindi, rimuovere il tappo dal tubo di conservazione e far scorrere l'estremità dell'impugnatura della cannula verso l'estremità aperta del tubo. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere un pezzo di tubo in polietilene dal becher e inserirlo all'interno della cannula metallica sterile, assicurandosi che si muova liberamente. Posizionare un segno guida in una posizione predeterminata con una penna indelebile.

Quindi, inserire un ago sterile monouso calibro 25 sull'estremità libera del tubo in polietilene facendo scorrere l'ago di diversi millimetri nel tubo. Quindi, utilizzare la soluzione salina sterile per riempire una nuova siringa monouso da 1 millilitro. Collegare la siringa all'ago montato sul tubo in polietilene e far scorrere l'intero volume di soluzione fisiologica attraverso il tubo.

Gettare la siringa usata nel contenitore per oggetti taglienti. Quindi, riempire una nuova siringa sterile monouso da 1 millilitro con l'inoculo a base di agar dal bagnomaria. Ricollegare l'ago e il tubo calibro 25 e far scorrere l'agar attraverso il tubo premendo lo stantuffo fino a quando il tubo non è completamente riempito di agar.

Dopo aver anestetizzato il ratto secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale in posizione supina sul tappetino monouso, con la testa rivolta a destra e la coda rivolta a sinistra. Quindi, inserisci l'estremità libera della cannula metallica nella bocca dell'animale. Ruotare la cannula in modo che l'estremità libera sia angolata verso l'alto e farla avanzare delicatamente nella trachea, bypassando accuratamente le strutture laringee con un leggero movimento rotatorio.

Confermare l'inserimento nella trachea anziché nell'esofago facendo scorrere delicatamente la cannula leggermente in avanti e indietro più volte, mentre si utilizza l'indice sinistro per palpare gli anelli tracheali.

Per garantire l'intubazione nella trachea e non nell'esofago, muovere leggermente la cannula avanti e indietro e sentire le creste. Se la cannula scivola dolcemente lungo la gola e le creste non possono essere percepite, rimuovere il dispositivo e riprovare.

Quando la cannula raggiunge la biforcazione in cui la trachea si divide nei bronchi sinistro e destro, fare un leggero movimento di torsione verso il lato sinistro dell'animale per assicurarsi che la cannula sia inserita nel bronco sinistro.

Un errore comune è non posizionare l'inoculo abbastanza in profondità nel polmone, che può bloccare le vie aeree e inibire la respirazione. Quando una cannula viene ruotata all'angolazione corretta, dovrebbe scivolare facilmente nel bronco sinistro e avanzare dolcemente fino alla profondità appropriata.

Far avanzare la cannula metallica fino a metà corsa a 3/4 del polmone sinistro, utilizzando il segno guida precedentemente posizionato per confermare che sia stata raggiunta la profondità appropriata. Con la cannula metallica in posizione, far avanzare il tubo in polietilene di diversi millimetri utilizzando il segno guida precedentemente posizionato sul tubo per assicurarsi che sia avanzato solo quanto basta per uscire dall'estremità della cannula metallica e non perforare il polmone.

Con entrambe le cannule in posizione, utilizzare la siringa in dotazione per instillare 100 microlitri di sospensione di agar in profondità nel grande lobo del polmone sinistro. Prelevare alcuni millimetri del tubo e rimuovere delicatamente il dispositivo di intubazione intatto. Rimettilo nel tubo di vetro e sposta l'animale in una gabbia fresca per riprenderlo.