Imaging in tempo reale della fagocitosi macrofagica dei globuli rossi opsonizzati IgG

Prendi una diapositiva del canale contenente macrofagi di topo. Il canale si collega a serbatoi pieni di substrati, fornendo nutrienti ai macrofagi.

Sostituire i terreni con anticorpi marcati in fluorescenza contenenti terreni che si legano a specifiche glicoproteine di superficie, marcando i macrofagi.

Prendiamo i globuli rossi umani, i globuli rossi, con membrane cellulari marcate in fluorescenza. Opsonizzare i globuli rossi con anticorpi IgG di topo, che si legano specificamente alla glicoforina A.

Aggiungere i globuli rossi opsonizzati con IgG al vetrino contenente macrofagi. I recettori Fc dei macrofagi legano la regione Fc delle IgG sui globuli rossi, determinando il raggruppamento dei recettori Fc attorno all'area di contatto e marcando i globuli rossi per la fagocitosi.

Il legame innesca le vie di segnalazione intracellulare e attiva le GTPasi. Le GTPasi attivate guidano la riorganizzazione e la polimerizzazione dell'actina, formando sottili sporgenze di membrana chiamate filopodi.

Inoltre, i filopodi si estendono intorno ai globuli rossi, racchiudendoli all'interno della coppa fagocitaria in via di sviluppo. I bordi della coppa si fondono, formando un fagosoma che internalizza i globuli rossi opsonizzati per la degradazione.

Utilizzando un microscopio confocale, è possibile ottenere immagini time-lapse di singoli eventi fagocitici.

Per marcare i macrofagi peritoneali, sostituire il terreno di bicarbonato in ciascun vetrino con un terreno completo integrato con HEPES e inclinare il vetrino per consentire l'aggiunta di 100 microlitri dell'anticorpo specifico per macrofagi di interesse marcato in fluorescenza all'apertura del canale da 100 microlitri del vetrino. Aspirare il terreno che scorre nel serbatoio a valle e incubare le cellule per 20 minuti in una camera umida a 37 gradi Celsius in assenza di anidride carbonica.

Mentre le cellule peritoneali vengono etichettate, mescolare delicatamente il campione di globuli rossi da 4 a 2.000 e trasferire 400 microlitri di cellule in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 millilitri in un blocco di alluminio riscaldato all'interno di una cappa a flusso laminare per circa 5-8 minuti.

Quando le cellule si sono riscaldate a 37 gradi Celsius, mescolare 0,4 microlitri di una colorante di membrana plasmatica fluorescente rossa appropriata con le cellule e riposizionare le cellule nel blocco termico. Dopo 5 minuti, lavare le cellule aggiungendo 1,6 millilitri di terreno completo fresco integrato con HEPES e centrifugare. Ruotare il tubo per identificare il pellet di globuli rossi.

Utilizzando un puntale per pipetta da 1 a 1,5 millilitri, rimuovere con cura il surnatante in due volumi senza disturbare il pellet. Quindi, mescolare 2.000 microlitri di terreno completo fresco integrato con HEPES con le cellule. Centrifugare e risospendere il pellet in 400 microlitri di terreno. Quindi, etichettare il tubo PMS per la colorazione della membrana plasmatica. Al termine dell'incubazione di 20 minuti per la marcatura delle cellule peritoneali, lavare il vetrino con 1 millilitro di terreno fresco completo integrato con HEPES.

Per opsonizzare i globuli rossi, aggiungere 1 microlitro di anticorpo monoclonale anti-umano CD235a di topo IgG2b alla provetta del campione PMS. Dopo 8 minuti a 37 gradi Celsius con miscelazione una volta al minuto, trasferire 100 microlitri di globuli rossi umani colorati con membrana plasmatica e opsonizzati con IgG al vetrino del canale peritoneale contenente macrofagi. Non appena i globuli rossi umani sono stati aggiunti, montare il vetrino su un microscopio confocale a disco rotante con l'incubatrice a tavolino impostata a 37 gradi Celsius e iniziare immediatamente l'imaging delle cellule.