Misurazione della migrazione delle cellule natural killer in risposta a stimoli chemiotattici

Inizia aggiungendo chemioattrattivi, come una chemochina, in una piastra multipozzetto.

Posizionare nel pozzetto una camera permeabile al pozzetto di dimensioni appropriate per i pori. Aggiungere la sospensione cellulare natural killer, o NK, alla camera superiore e incubare.

Alcune molecole di chemochine si diffondono attraverso la membrana e si legano ai recettori delle cellule NK. Ciò innesca vie di segnalazione che promuovono i cambiamenti del citoscheletro, con conseguente movimento cellulare direzionale verso la maggiore concentrazione di chemioattrattivo nella camera inferiore.

Dopo l'incubazione, trasferire un volume fisso di cellule migrate dalla camera inferiore a una provetta di smistamento cellulare attivata a fluorescenza o FACS. Aggiungere un numero predeterminato di microsfere fluorescenti ed eseguire il conteggio delle cellule basato su FACS.

Utilizzando la seguente formula, determinare il numero assoluto di cellule NK migrate nel campione.

Il grafico a punti fornisce il numero di perle di conteggio e cellule separate come regioni distinte, in base alle loro proprietà di fluorescenza e dispersione.

Per misurare la migrazione delle cellule NK in risposta a stimoli chemiotattici, raccogliere cellule NK umane da una coltura confluente dal 70% all'80% e risospendere le cellule a una concentrazione di 2,5 x 10⁶ cellule per millilitro di terreno di coltura di cellule NK prive di siero. Quindi, aggiungere 600 microlitri di terreno privo di siero contenente il chemioattrattivo per cellule NK di interesse per pozzetto.

E posizionare un inserto di coltura di 6,5 millimetri di diametro con pori di 5 micrometri in ciascun pozzetto di terreno. Quindi, aggiungere 100 microlitri di cellule NK allo scomparto superiore di ciascun inserto e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per quattro ore.

Al termine dell'incubazione, trasferire l'intero volume di cellule migrate non aderenti dal fondo di ciascun pozzetto in singole provette FACS da 5 millilitri e aggiungere 15 microlitri di un numero predeterminato di perle di conteggio per citometria a flusso in ciascuna provetta. Quindi, utilizzando un citometro a flusso, valutare ogni campione di cellule secondo i protocolli standard di analisi citofluorimetrica e calcolare il numero assoluto di cellule NK migrate utilizzando la formula.