Analisi dell'efferocitosi dei timociti apoptotici da parte dei macrofagi peritoneali

L'efferocitosi è il processo mediante il quale le cellule fagocitiche eliminano le cellule apoptotiche.

Per analizzare l'efferocitosi, ottenere timociti di topo sensibili all'apoptosi. Incubare con colorante CFSE permeabile alle cellule.

Le esterasi intracellulari scindono la CFSE in un colorante fluorescente impermeabile alle cellule, colorando i timociti. Aggiungere siero inattivato a caldo per evitare macchie eccessive.

Placcare i timociti colorati su una piastra di coltura. Aggiungere la staurosporina, un inibitore della proteina chinasi, che interrompe la cascata critica della segnalazione cellulare, inducendo l'apoptosi. Inoltre, i residui di fosfatidilserina si traslocano nel lembo esterno della membrana cellulare, funzionando come "segnali mangiami".

Aggiungere concentrazioni crescenti di timociti apoptotici a pozzetti di piastre multipozzetto contenenti macrofagi peritoneali di topo attivati, che esprimono specifiche tirosin-chinasi recettoriali.

Queste chinasi legano la fosfatidilserina esposta sui timociti apoptotici, facilitandone l'internalizzazione da parte dei macrofagi.

Dopo l'incubazione, rimuovere i timociti apoptotici fluttuanti. Aggiungere anticorpi anti-CD11b marcati con fluorofori, che si legano alle molecole CD11b dei macrofagi.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, osservare timociti apoptotici fluorescenti all'interno di macrofagi diversamente fluorescenti, indicando efferocitosi.

I pozzetti con concentrazioni di timociti apoptotici più elevate mostrano un aumento dei timociti internalizzati.

Per raccogliere i timociti dopo aver aperto la cavità toracica di un topo ingenuo C57/Black-6, utilizzare una pinza a punta fine curva per estrarre il timo. Posizionare l'organo in una piastra di coltura tissutale contenente 10 millilitri di terreno RPMI-1640. Macinare l'intero timo contro le estremità smerigliate di 2 vetrini da microscopio e filtrare la sospensione tissutale risultante attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Raccogliere i timociti per centrifugazione e risospendere il pellet in 40 millilitri.

Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere fino a 2 x 10⁸ cellule in 20 millilitri di PBS fresco per provetta da 50 millilitri. Etichettare le cellule con CFSE a 5 micromolari in 20 millilitri di PBS per provetta. Capovolgere le provette due o tre volte per mescolare, prima di incubare i timociti per non più di 2 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, interrompere la reazione con 10 millilitri di siero di cavallo inattivato a caldo e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere le cellule marcate in 40 millilitri di PBS fresco per il conteggio e la centrifugazione, seguito da un ulteriore lavaggio con 40 millilitri di terreno. Dopo il lavaggio con mezzo, risospendere i timociti a una concentrazione di terreno di coltura tissutale di 7 x 10⁶ cellule per millilitro e seminare le cellule in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri. Quindi, aggiungere la staurosporina alla coltura cellulare a una concentrazione finale di 1 micromolare e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 4 ore.

Per l'isolamento dei macrofagi peritoneali, iniettare due topi C57/Black-6 per via intraperitoneale con 1 millilitro di tioglicolato invecchiato al 3% al giorno 0, prima di aprire la pelle addominale senza disturbare il peritoneo il giorno 5.

Per lavare la cavità peritoneale, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per spingere rapidamente 10 millilitri di tampone di lavaggio nella cavità prima di aspirare lentamente il tampone di lavaggio per la raccolta in una provetta da 50 millilitri. Lavare la sonda peritoneale due volte con PBS. Risospendere i macrofagi peritoneali a una concentrazione di 2 volte 10 al sesto per millilitro di terreno di coltura tissutale.

Quindi, seminare 500 microlitri di macrofagi in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 2 ore. Al termine dell'incubazione, aspirare il surnatante per rimuovere le cellule galleggianti e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura tissutale a ciascun pozzetto.

Aggiungere immediatamente da 0 a 12 x 10⁶ timociti in 500 microlitri di terreno a ciascun pozzetto della coltura e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura tissutale per 4 ore. Al termine dell'incubazione, lavare ogni pozzetto due volte con PBS fresco per rimuovere eventuali cellule apoptotiche libere, seguito da un singolo lavaggio con tampone di colorazione. Quindi, etichettare i macrofagi legati alla piastra con 200 microlitri di tampone colorante integrato con un anticorpo anti-CD11b appropriato per pozzetto e posizionare la piastra a 4 gradi Celsius per 20 minuti.