JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:35 min • July 8th, 2025
Prendi ceppi virulenti e meno virulenti di Staphylococcus aureus.
Aggiungi il siero per opsonare i batteri.
Trasferire le concentrazioni batteriche crescenti in pozzetti a piastre multipozzetto refrigerati contenenti neutrofili. Le basse temperature impediscono l'attivazione dei neutrofili.
Centrifuga per facilitare la fagocitosi sincronizzata.
I recettori dei neutrofili legano le opsonine, innescando l'internalizzazione batterica nei fagosomi.
Nei batteri virulenti, l'ambiente fagosomiale innesca l'espressione di tossine citolitiche.
Queste tossine formano pori, distruggendo i fagosomi e compromettendo l'integrità della membrana dei neutrofili.
Tuttavia, i batteri meno virulenti mostrano una ridotta espressione della tossina citolitica.
Dopo l'incubazione, staccare i neutrofili e trasferirli in provette per citometro a flusso contenenti colorante fluorescente allo ioduro di propidio (PI).
Il colorante entra nei neutrofili con membrane compromesse e colora il DNA.
Utilizzando un citometro a flusso, analizzare i neutrofili per la colorazione PI.
Un aumento concentrazione-dipendente della proporzione di neutrofili PI-positivi in seguito alla fagocitosi del ceppo virulento, rispetto al ceppo meno virulento, indica la citotossicità del ceppo virulento nei confronti dei neutrofili.
Quando lo Stafilococco aureo in subcoltura ha raggiunto una crescita esponenziale media, trasferire 1 millilitro di batteri coltivati in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 5000 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare S. aureus aspirando il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere i batteri pellettati in DPBS da 1 millilitro. Agitare i campioni per 30 secondi. Centrifugare i campioni a 5000 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Per opsonizzare lo Stafilococco aureo, in primo luogo, risospendere il pellet batterico in 1 millilitro di siero umano al 20%. Quindi, incubare i campioni a 37 gradi Celsius con agitazione per 15 minuti. Lavare lo stafilococco aureo opsonizzato dopo la centrifugazione, come mostrato in precedenza. Diluire i ceppi di Stafilococco aureo opsonizzati a 1 x 108 unità formanti colonie, CFU per millilitro, con RPMI ghiacciato. Agitare il campione per 30 secondi e metterlo sul ghiaccio.
Confermare le concentrazioni di Stafilococco aureo utilizzate per questi saggi piastrando da 1 a 10 diluizioni seriali di batteri su agar. Aggiungere delicatamente, 100 microlitri per pozzetto di ciascun ceppo di Stafilococco aureo, o RPMI, per controlli positivi e negativi, ai PMN in una piastra a 96 pozzetti su ghiaccio dal passaggio 1.14. Scuotere delicatamente la piastra per distribuire lo Stafilococco aureo nei pozzi.
Sincronizzare la fagocitosi centrifugando la piastra a 500 g per otto minuti a 4 gradi Celsius e incubare la piastra a 37 gradi Celsius, immediatamente dopo la centrifugazione come tempo 0. Nei punti temporali desiderati, mettere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 200 microlitri di DPBS ghiacciato contenente 1 microlitro di ioduro di propidio a ciascuna provetta per citometria a flusso, quindi trasferire i campioni nella provetta corrispondente.