JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:26 min • July 8th, 2025
Esporre un topo a goccioline di aerosol contenenti Mycobacterium tuberculosis.
I batteri raggiungono il lume degli alveoli, le minuscole sacche d'aria all'interno dei polmoni, che contengono macrofagi.
I recettori di riconoscimento dei modelli di macrofagi si legano ai modelli molecolari associati ai patogeni sui batteri, innescando il loro inghiottimento in un fagosoma.
I batteri inghiottiti secernono proteine specializzate, che rompono la membrana del fagosoma. I batteri fuoriescono nel citoplasma e si riproducono.
Dopo l'infezione, anestetizzare il topo. Somministrare intraperitonealmente un substrato reporter dell'enzima batterico β-lattamasi per la fluorescenza dell'enzima reporter o l'imaging REF.
Il substrato raggiunge gli alveoli polmonari attraverso la circolazione ed entra nelle cellule infette.
Penetra nella membrana esterna batterica per raggiungere lo spazio periplasmatico contenente β-lattamasi.
Il substrato contiene un anello β-lattamico che collega un fluorocromo e un quencher. A causa della prossimità, la fluorescenza del fluorocromo viene assorbita dal quencher.
La β-lattamasi idrolizza l'anello β-lattamico, rilasciando il fluoroforo e provocando l'emissione di fluorescenza.
Visualizzare la fluorescenza per valutare l'infezione micobatterica.
Per procedere, caricare gli animali di peso noto nella camera di inoculazione potenziata. La camera può ospitare fino a 90 topi. Quindi, chiudere tutti i fermi della porta. Quindi, collegare il nebulizzatore utilizzando una fascetta in acciaio. Quindi, premere il pulsante di avvio sulla camera e impostare la portata d'aria tra 3 e 5 litri al minuto.
L'aria compressa fluirà a circa 22-26 libbre per pollice quadrato e, soprattutto, dovrebbe essere possibile vedere la nebbia di inoculo nella camera. Dopo 15 minuti, apparirà una luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indicherà la fine della corsa. Quindi, premere il pulsante di ripristino per azzerare i timer. Per rilasciare il vuoto, premere il piccolo pulsante rosso sullo sportello della camera.
Quindi, apri la porta della camera e riporta i topi nelle loro gabbie domestiche. Andando avanti, tieni gli animali nella stanza di contenimento. Quindi, rimetti il barattolo nel contenitore di trasporto nell'armadio di biosicurezza. Lì, gettare la sospensione batterica rimanente in un contenitore per rifiuti designato. Quindi, posizionare il barattolo del nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto a rischio biologico e sigillare il sacchetto per il trasporto in autoclave.
Per pulire la camera, spruzzare le superfici interne con fenolo tamponato ed etanolo al 70%. Lasciare che queste soluzioni reagiscano su quelle superfici per 10 minuti, quindi pulirle accuratamente. Smaltire tutte le salviette nella spazzatura a rischio biologico. Quindi, sterilizzare in autoclave la spazzatura, il contenitore dei rifiuti e i barattoli del nebulizzatore usati.
Trasferire gli animali nella sala di imaging. Lì, anestetizzare un animale secondo il protocollo di testo e iniettarlo con substrato di contrasto mediante iniezione intraperitoneale. Nel software del sistema di imaging, inizializzare il sistema e procedere quando la barra della temperatura diventa verde. Dopo aver inizializzato il sistema, posizionare il mouse nella camera di imaging.
Assicurati che le sue narici siano all'interno del cono del naso in modo che riceva l'anestetico durante l'imaging. Ora torna al computer. Nel pannello di controllo dell'acquisizione, selezionare la fluorescenza, la transilluminazione, per la visualizzazione dell'intero animale, o l'epi-illuminazione per visualizzare i tessuti polmonari. Per un singolo mouse, impostare il campo visivo su B e il livello della lampada su alto.
Per l'esposizione, utilizzare il tempo automatico, il binning medio e due o tre per l'F/Stop. Quindi, impostare il filtro di eccitazione a 745 nanometri e i filtri di emissione da 780 a 840 nanometri. Quindi, vai alla configurazione della sequenza e seleziona da 9 a 12 punti di transilluminazione nell'area di interesse. Ora premi il pulsante di acquisizione per raccogliere le immagini.