Valutazione della virulenza della Leishmania nei macrofagi in coltura

Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente macrofagi derivati dal midollo osseo su vetrini.

Tratta i macrofagi con Leishmania promastigotes, lo stadio infettivo del parassita.

Durante l'incubazione, i parassiti interagiscono con i macrofagi, facilitando l'assemblaggio di F-actina attorno al sito di interazione.

I macrofagi inghiottono i parassiti nei fagosomi circondati da F-actina, formando vacuoli parassitofori o PV, una nicchia replicativa.

All'interno dei PV, i parassiti rilasciano fattori di sopravvivenza, aumentando l'accumulo di F-actina intorno ai vacuoli e inibendo la loro fusione con i lisosomi.

Inoltre, i parassiti regolano la produzione di epcidina, un ormone peptidico macrofagico, che inibisce il rilascio di ferro e aumenta i livelli intracellulari di ferro.

L'afflusso di ferro nei vacuoli favorisce la differenziazione dei promastigoti in amastigoti patogeni e ne facilita la moltiplicazione, aumentando la virulenza.

Dopo l'incubazione, lavare per rimuovere i parassiti liberi, quindi fissare e permeabilizzare i macrofagi infetti.

Introdurre un colorante fluorescente all'acido nucleico per colorare i nuclei di macrofagi e amastigoti infetti.

Al microscopio a fluorescenza, piccoli nuclei raggruppati attorno al grande nucleo del macrofago confermano la presenza di parassiti intracellulari, dimostrando la virulenza della Leishmania.

Il settimo o l'ottavo giorno dopo la coltura, utilizzare una punta di aspirazione montata su una linea del vuoto per trasferire quattro vetrini coprioggetti da 12 millimetri sterilizzati in autoclave sul fondo di ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti senza sovrapporsi. Prepara piastre identiche per ogni punto temporale dell'esperimento. Successivamente, lavare le colture di macrofagi derivate dal midollo osseo 2 volte con PBS fresco a 37 gradi Celsius e cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio, integrati con un millimolare di EDTA per ciascuna piastra.

Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, riunire le cellule staccate in un tubo conico da 50 millilitri, risciacquando ogni piastra due volte con altri cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio. Dopo la centrifugazione, risospendere i macrofagi in 5-10 ml di terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo su ghiaccio. Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di 5 x 10⁵ per millilitro in terreno di macrofagi fresco derivato dal midollo osseo e aggiungere due millilitri di cellule per pozzetto alla piastra a 6 pozzetti. Quindi, incubare le cellule per una notte nell'incubatore per colture cellulari.

Per infettare le cellule con L amazonensis, diluire la sospensione del parassita alla molteplicità sperimentale appropriata di infezione e aggiungere da 50 a 100 microlitri di parassiti a ciascun pozzetto di tutte le piastre a sei pozzetti, compresi tutti i punti temporali dell'esperimento. Incubare i macrofagi derivati dal midollo osseo per il periodo e la temperatura di infezione appropriati.

Quindi, lavare i pozzetti tre volte con due millilitri di PBS fresco a 37 gradi Celsius senza calcio o magnesio per pozzetto e fissare i campioni di punto temporale iniziale con 1,5-2 ml di paraformaldeide al 2% per 10 minuti. Per le piastre corrispondenti ai punti temporali successivi, aggiungere 2 millilitri di terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo a ciascun pozzetto e rimettere le piastre nell'incubatrice appropriata. Quindi, fissare e lavare le celle per ogni punto temporale rimanente come appena dimostrato e conservare i campioni a 4 gradi Celsius in PBS fresco.

Per colorare le cellule con DAPI, sostituire il surnatante con 1,5 ml di PBS fresco senza calcio e magnesio, integrato con detergente non ionico allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi da 2 millilitri con PBS senza calcio o magnesio. Successivamente, colorare le cellule con due microgrammi per millilitro di DAPI in 1 millilitro di PBS per un'ora a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi, posizionare i vetrini coprioggetti con la cella rivolta verso il basso su singoli vetrini da microscopio montati con un reagente di montaggio anti-sbiadimento disponibile in commercio.

Quindi, per quantificare il numero di cellule infette, utilizzare l'obiettivo a olio ad immersione 100x di un microscopio a fluorescenza e il contatore Emanuel per identificare il numero di nuclei di amastigote più piccoli raggruppati attorno a ciascun grande nucleo di macrofago colorato con DAPI.