JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:30 min. • July 8th, 2025
Al microscopio, osservare gli organoidi gastrici, le strutture cellulari tridimensionali composte da cellule gastriche differenziate e le cellule staminali.
Introdurre un microiniettore caricato con Helicobacter pylori, un patogeno gastrico.
Inserire l'ago nell'organoide bersaglio e iniettare la sospensione batterica.
Osservare una soluzione torbida svilupparsi all'interno del lume.
H.pylori impiega una specifica proteina adesina sulla sua superficie per legarsi al recettore delle cellule gastriche, stabilendo un'interazione stabile tra i batteri e le cellule ospiti.
Questa interazione innesca l'allungamento della secrezione batterica del pilo, una grande struttura a forma di tunnel che si estende verso la membrana della cellula ospite.
H. pylori utilizza la secrezione pilus per iniettare fattori di virulenza, tra cui il gene citotossico associato A o CagA nella cellula ospite.
Una volta all'interno della cellula, CagA subisce fosforilazione da parte della chinasi della cellula ospite.
IlCagA fosforilato deregola molteplici cascate di segnalazione intracellulare che alterano le funzioni della cellula ospite, promuovendo la trasformazione cancerosa.
Raccogli gli organoidi infetti per ulteriori analisi.
Per iniziare la microiniezione di organoidi, raccogliere i batteri di H. pylori e lavarli in terreno basale secondo i protocolli standard. Dopo le misurazioni della densità ottica per determinare il numero di batteri, diluire la coltura a 1 x 109 batteri per millilitro in terreno basale.
Estrarre il capillare di vetro in due aghi per iniezione utilizzando un estrattore per micropipette e conservare in una capsula di Petri pulita. Quindi, usando una pinza, rompere la punta di un ago da iniezione per produrre un'apertura larga circa 10 micrometri.
Lavorando su uno stereomicroscopio, installato all'interno di una cappa di coltura sterile, inserire l'ago nel supporto per iniezione e fissarlo al micromanipolatore. Prelevare circa 10 microlitri di soluzione batterica nell'ago. Quindi, posizionare la piastra di coltura cellulare a 4 pozzetti contenente organoidi gastrici sotto lo stereomicroscopio.
Navigando con il micromanipolatore, posizionare l'ago vicino a un organoide. Inserire l'ago nell'organoide con un movimento rapido, quindi iniettare circa 0,2 microlitri di soluzione batterica al centro dell'organoide. Con l'esperienza, circa 30 dei più grandi organoidi in un pozzetto possono essere iniettati in 5 minuti. Incubare gli organoidi iniettati per il tempo desiderato in un incubatore per colture cellulari.
Spesso, gli individui che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché hanno difficoltà a indirizzare in modo efficiente gli organoidi. Gli organoidi gastrici di topo crescono cistici e sono i più facili da colpire. Quindi, l'iniezione di organoidi gastrici di topo con, ad esempio, un colorante, può essere una buona pratica per questa tecnica.