Valutazione della crescita intracellulare di mutanti di Coxiella all'interno di cellule eucariotiche

Prendete una piastra multi-pozzetto contenente cellule epiteliali aderenti e trattatela con mutanti Coxiella marcati con proteine fluorescenti verdi, alcune con mutazioni nel gene del sistema di secrezione di tipo IV, o gene T4SS, cruciale per la replicazione.

I mutanti replicativi interagiscono con le cellule epiteliali, innescando l'inghiottimento di Coxiella, formando il vacuolo contenente Coxiella, o CCV, e reclutando la glicoproteina di membrana associata al lisosoma-1, o LAMP1 in CCV.

Ciò facilita la secrezione delle proteine effettrici nel citoplasma cellulare attraverso il sistema di secrezione di tipo IV, promuovendo la replicazione batterica.

I mutanti con mutazioni del gene T4SS rimangono non replicati.

Dopo l'incubazione, colorare le cellule con un colorante fluorescente, fissarle e permeabilizzare la membrana cellulare.

Introdurre gli anticorpi primari specifici per LAMP1 che interagiscono con le proteine LAMP1 sulla CCV.

Sovrapposizione con anticorpi secondari marcati con fluoroforo rosso, che interagiscono con gli anticorpi primari, mentre il colorante Hoechst colora i nuclei delle cellule.

Al microscopio a epifluorescenza, i vacuoli a fluorescenza rossa contenenti m