Un test di infezione batterica per lo studio delle interazioni batteri-cellule ospiti anaerobiche

Inizia con una coltura di cellule endoteliali.

Sostituire il supporto con un supporto anaerobico. Incubare in una camera anaerobica per l'equilibrio della temperatura.

Aggiungere il Porphyromonas gingivalis, un batterio anaerobio patogeno, e incubare brevemente.

I batteri possiedono proiezioni proteiche, note come fimbrie, che si legano a specifiche molecole di adesione sulle cellule endoteliali, facilitando l'adesione batterica.

Questo legame innesca cascate di segnalazione intracellulare, con conseguente riarrangiamento del citoscheletro di actina e internalizzazione batterica nei fagosomi.

Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno. Lavare con un tampone anaerobico per rimuovere i batteri extracellulari non aderiti.

Aggiungere un detergente delicato per permeabilizzare le membrane cellulari dell'ospite e indurre la lisi cellulare, rilasciando batteri internalizzati e attaccati alla superficie senza causare danni.

Diluire i batteri contenenti lisato con terreni e preparare diluizioni seriali.

Piastra queste diluizioni su piastre di agar sanguigno. Incubare in condizioni anaerobiche per consentire a Porphyromonas gingivalis di proliferare e formare colonie.

Dopo l'incubazione, contare le unità formanti colonie (CFU) su ciascuna piastra per quantificare i batteri attaccati alla superficie e internalizzati, indicando le interazioni batterio-cellula ospite.

Per la coltura e la sperimentazione con Porphyromonas gingivalis, una camera anaerobica in vinile viene mantenuta con un'atmosfera artificiale contenente l'80% di azoto, il 10% di idrogeno e il 10% di anidride carbonica.

Posizionare 30 piastre di agar sanguigno, 500 millilitri di PBS e millilitri di fattore di crescita endoteliale vascolare, o terreno VEGF, all'interno della camera anaerobica con 24 ore di anticipo per equilibrare i reagenti.

Seminare 4 volte 10 nelle 5 cellule endoteliali della vena ombelicale umana, o HUVECs, per pozzetto in piastre a sei pozzetti in terreno VEGF e lasciarle nell'incubatore di coltura cellulare per una notte per l'attaccamento. Preparare le colture di Porphyromonas gingivalis in infusione cervello-cuore, o terreno BHI, come descritto nel testo di accompagnamento, e lasciare che le colture raggiungano la fase logaritmica mentre la densità ottica della coltura a 660 nanometri varia tra 0,5 e 0,7.

Trasferisci i batteri in una provetta da 15 millilitri e avvolgi un pezzo di parafilm attorno al tappo per prevenire l'esposizione aerobica. Quindi, centrifugare i batteri a 5.000 volte g per 10 minuti. All'interno della camera anaerobica, lavare i batteri pellettati con PBS anaerobico e centrifugare nuovamente a 5.000 volte g per 10 minuti. Risospendere i batteri nel terreno VEGF.

Per infettare gli HUVEC con Porphyromonas gingivalis, trasferire le piastre a sei pozzetti dall'incubatore alla camera anaerobica. Aspirare il terreno dai pozzetti di prova e lavare tre volte con PBS anaerobico.

Determinare il numero di cellule da un pozzetto rappresentativo mediante il saggio di esclusione del blu di tripano. Quindi, aggiungere 2 millilitri per pozzetto di terreno anaerobico VEGF e posizionare le piastre a 37 gradi Celsius nell'incubatore anaerobico per 20 minuti per equilibrarle.

Determinare la densità ottica dei batteri e risospenderli in un volume adeguato di terreno VEGF per infettare le cellule con una molteplicità di infezione di 100 a 1 rapporto batteri-cellule. Aggiungere la sospensione batterica alle cellule e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per l'infezione. Per la lisi cellulare, all'interno della camera anaerobica, preparare una soluzione di saponina all'1% in peso per volume in terreno BHI e filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron.

Per studiare le interazioni batteriche con le cellule ospiti, rimuovere la piastra a sei pozzetti dall'incubatore e aspirare il mezzo di infezione. Lavare tre volte con PBS anaerobico. Quindi, aggiungere 2 millilitri di soluzione di saponina a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti per consentire la lisi cellulare.

Quindi, raschiare le cellule dal fondo del pozzetto e diluire il lisato cellulare 1 a 1 con terreno BHI. Quindi, fare diluizioni seriali a partire da 1 a 100. Piastra 200 microlitri di diluizione adeguata su piastre di agar sanguigno. Avvolgere le piastre con parafilm e incubarle in un'incubatrice anaerobica a 37 gradi Celsius per sette giorni per consentire la formazione di colonie. Quindi, utilizzando una scatola luminosa, conta le unità formanti colonie, o CFU, su ciascuna piastra.