Visualizzazione dei batteri anaerobi internalizzati all'interno delle cellule endoteliali dell'ospite

Iniziare con una sospensione di Porphyromonas gingivalis in crescita attiva, un batterio patogeno anaerobico.

Aggiungere BCECF-AM, un colorante non fluorescente e permeabile alle cellule.

Le esterasi citoplasmatiche attive idrolizzano il colorante in una forma fluorescente e impermeabile alle cellule, colorando i batteri.

centrifuga. Risospendere i batteri in mezzi anaerobici.

Aggiungere i batteri marcati a pozzetti per piastre a più pozzetti contenenti vetrini coprioggetti con cellule endoteliali umane aderenti.

Incubare in una camera anaerobica.

Le fimbrie batteriche si legano ai recettori della superficie delle cellule endoteliali, avviando cascate di segnalazione intracellulare.

Questo porta al riarrangiamento dell'actina e all'internalizzazione batterica all'interno dei fagosomi.

Dopo l'incubazione, lavare i vetrini coprioggetti con tampone per rimuovere i batteri non internalizzati.

Fissare le cellule con paraformaldeide per preservare le strutture cellulari. Permeabilizzare le cellule con un detergente non ionico per accedere ai bersagli intracellulari.

Aggiungere falloidina marcata in fluorescenza, che si lega ai filamenti di actina.

Posizionare il vetrino coprioggetti su un supporto di montaggio contenente DAPI, che colora il DNA.

Osservare il Porphyromonas gingivalis fluorescente all'interno delle cellule endoteliali con actina fluorescente, confermando l'internalizzazione batterica.

Per visualizzare i batteri internalizzati, in primo luogo, trasferire asetticamente i vetrini coprioggetti in vetro autoclavato all'interno di ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Placcare cinque volte 10 con i quattro HUVEC per pozzetto sul vetrino coprioggetti e incubare per 24 ore. Per marcare i batteri, centrifugare i batteri in fase mid-log e risospendere il pellet con PBS anaerobico. Centrifugare nuovamente e ripetere la fase di lavaggio.

Aggiungere 20 microlitri di BCECF-AM da 0,2 millimolari a due millilitri di PBS anaerobico contenente da cinque a sette volte 10 all'ottavo batterio per millilitro. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti al buio.

Il colorante fluorescente che utilizziamo può macchiare la maggior parte dei batteri anaerobi. Pertanto, non sono necessari altri reagenti, come un anticorpo specifico.

Centrifugare la sospensione batterica a 5.000 volte g per 10 minuti per rimuovere il reagente di marcatura non legato e risospendere i batteri nel terreno VEGF. Quindi, infettare le cellule HUVEC in un rapporto di 100 a 1, batteri contro cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi, aggiungere il 4% di paraformaldeide e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per fissare le cellule nella camera anaerobica.

Rimuovere le celle fissate dalla camera, quindi lavare i vetrini coprioggetti con PBS tre volte. Incubare i vetrini coprioggetti in un millilitro di Triton X-100 allo 0,2% per 10 minuti per permeabilizzare le cellule. Quindi, lavare i vetrini coprioggetti con PBS tre volte. Ora, aggiungere 50 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di falloidina TRITC a ciascun vetrino coprioggetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente per colorare l'actina oligomerica cellulare.

Dopo l'incubazione, lavare il vetrino coprioggetti con PBS tre volte. Capovolgere il vetrino coprioggetti su un vetrino con un terreno di montaggio soft-set contenente un microgrammo per millilitro DAPI per la colorazione nucleare. Quindi, sigillare la periferia del vetrino coprioggetti con smalto per unghie e osservare al microscopio confocale.