JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:29 min • July 8th, 2025
Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente una sospensione di Streptococcus pneumoniae.
Introdurre anticorpi mirati all'antigene di superficie batterica, che interagiscono con gli antigeni di superficie batterici. Questo ricopre i batteri di anticorpi, formando batteri opsonizzati per il riconoscimento immunitario.
Seminare i pozzetti con neutrofili derivati da linfociti del sangue periferico umano integrati con siero di coniglio contenente proteine del complemento.
Durante l'incubazione, le proteine del complemento come il C3b si depositano sulla superficie batterica, portando a un ulteriore rivestimento di opsonina sui batteri opsonizzati con anticorpi, migliorando il riconoscimento batterico da parte dei neutrofili.
I recettori di superficie specifici sui neutrofili interagiscono con le opsonine sui batteri, facilitando l'inghiottimento batterico attraverso la fagocitosi.
All'interno del fagosoma, i neutrofili degradano i batteri inghiottiti, riducendo la carica batterica nel tampone.
Dopo l'incubazione, posizionare la soluzione di co-coltura diluita su una piastra di agar sanguigno per consentire ai singoli batteri di formare colonie.
Confrontare il numero di colonie nei batteri trattati con opsonina con i batteri non trattati.
Un minor numero di colonie con trattamento con opsonina indica una maggiore uccisione batterica, suggerendo un successo dell'uccisione opsonofagocitica.
Scongelare un tubo di brodo batterico. Pellettare i batteri a 6.000 volte g per due minuti e risospendere il pellet cellulare in OBB alla diluizione ottimale ottenuta nel passaggio precedente. Pipettare 10 microlitri di diluizione batterica risospesa per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a fondo rotondo da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 20 microlitri di un anticorpo appropriato o di un trattamento farmacologico a ciascun pozzetto sperimentale in duplicato.
Per i pozzetti di controllo, utilizzare 1X PBS o OBB, a seconda del tampone utilizzato per i pozzetti di trattamento. Agitare la piastra del campione a circa 90 giri/min a temperatura ambiente per un'ora.
Per raccogliere le cellule differenziate con HL60 trattate con DMF tre giorni prima, pellettare le cellule a 500 volte g per tre minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet con almeno 10 millilitri di 1XPBS. Pellettare le celle lavate a 500 volte g per tre minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nell'OBB.
Aggiungere il siero sterile non diluito di coniglietto a un volume finale da uno a cinque. Dopo un'ora di coltura batterica, dividere ogni campione in pozzetti duplicati per due gruppi. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della miscela di complemento HL60 a ciascun set sperimentale di pozzetti e 50 microlitri di OBB solo ai pozzetti dei batteri. Agitare la piastra a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius per un'ora.
Per impiattare i campioni, diluire ciascun pozzetto con OBB a un volume finale da uno a cinque in modo che ogni campione abbia un volume di almeno 50 microlitri. Quindi, pipettare 50 microlitri di ciascun campione direttamente su un'area designata di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra i campioni. Coprire e lasciare asciugare i campioni per circa 15 minuti a temperatura ambiente.
Capovolgere le piastre e coltivare per una notte a 30 gradi Celsius. In alternativa, piastre di coltura in barattoli anaerobici, per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o per controllarne la morfologia. Dopo la coltura notturna, contare le colonie in ciascuna area di campionamento designata e procedere all'analisi dei dati confrontando il numero di cellule vive in ciascun set con i controlli corrispondenti.
Gli aspetti più difficili della messa a punto di questa tecnica per la prima volta saranno probabilmente l'ottimizzazione delle CFU di partenza del ceppo batterico, oltre a garantire che le cellule HL60 siano differenziate in modo efficace.