JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:18 min • July 8th, 2025
Iniziare con le sottopopolazioni di macrofagi M1 e M2 aderenti, distinte dai loro specifici marcatori di superficie. Queste cellule sono infettate da Mycobacterium tuberculosis marcato con fluorescenza.
Aggiungere il buffer FACS ai pozzetti delle colture.
L'EDTA nel tampone consente il distacco delle cellule dai pozzetti di coltura.
Trasferire la sospensione cellulare in provette per microcentrifuga.
Centrifugare le provette. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in un cocktail di anticorpi anti-macrofagi coniugati con fluorocromo e colorante di vitalità, Zombie-UV.
Il colorante a fluorescenza Zombie-UV entra nelle cellule morte attraverso le membrane danneggiate e si lega alle proteine citoplasmatiche, consentendo una chiara differenziazione dalle cellule vitali non colorate.
Inoltre, gli anticorpi anti-macrofagi coniugati fluorescenti si legano agli antigeni bersaglio sui macrofagi, consentendo il rilevamento differenziale delle sottopopolazioni.
Lavare le cellule per rimuovere gli anticorpi non legati. Centrifuga. Rimuovere il surnatante.
Risospendere le cellule in un tampone fissativo per reticolare le proteine, preservando la morfologia cellulare e inattivando i micobatteri per una manipolazione sicura durante l'analisi.
Infine, centrifugare ed elaborare i campioni per la citometria a flusso.
Utilizzare una strategia di gating appropriata per determinare la percentuale di sottopopolazioni infette da Mycobacterium.
Per colorare le cellule per la citometria a flusso, incubare le cellule infette con 1 millilitro di tampone FACS integrato con 0,5 millimolari di EDTA per pozzetto per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule staccate con un pipettaggio delicato e trasferirle in singole provette per microcentrifuga con tappo a vite per la centrifugazione.
Risospendere le cellule in circa 50 microlitri di cocktail di anticorpi anti-umani coniugati con fluorocromo e colorante di vitalità di interesse, e incubare le cellule per 30 minuti a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce.
Dopo il lavaggio, fissare le cellule con 200 microlitri di tampone di fissazione appena preparato per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Dopo la fissazione e il lavaggio, risospendere le cellule in 400 microlitri di tampone FACS e trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da 1 millilitro.
Per analizzare le cellule, utilizzare perle di compensazione per compensare il segnale fluorescente per ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo nel cocktail e utilizzare cellule non colorate per impostare il cancello per la popolazione cellulare negativa. Quindi, acquisire un minimo di 50.000 cellule per campione.