JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:25 min. • July 8th, 2025
Nel microambiente del cancro, i neutrofili attivati rilasciano trappole extracellulari di neutrofili, o NET, composte da fibre di DNA extracellulare, istoni e proteine granulari, che svolgono un ruolo cruciale nella progressione del cancro.
Per studiare l'adesione delle cellule tumorali NET in vitro, aggiungere la sospensione NET ai pozzetti della piastra a più pozzetti. Incubare per la formazione del monostrato NET.
Dopo l'incubazione, rimuovere i NET non aderenti.
Aggiungere una soluzione proteica per bloccare i siti di legame liberi nei pozzetti.
Pipettare le cellule tumorali marcate in modo fluorescente su monostrati NET.
Specifici recettori di superficie sulle cellule tumorali interagiscono con i NET, facilitando l'adesione cellulare.
Dopo l'incubazione, scartare il terreno dal pozzetto di controllo negativo.
Aggiungere desossiribonucleasi per degradare i NET, staccando le cellule.
Rimuovere le soluzioni dal controllo negativo e testare i pozzetti. Utilizzare il tampone per rimuovere le cellule non aderenti.
Fissare le cellule tumorali aderenti ai NET con la formaldeide.
Utilizzando un microscopio a fluorescenza, visualizza le cellule tumorali fluorescenti aderenti ai NET.
I pozzetti di prova mostrano una significativa adesione delle cellule tumorali ai NET, mentre i NET trattati con desossiribonucleasi mostrano livelli ridotti di adesione delle cellule tumorali.
Aggiungere 100 microlitri di stock NET in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius al buio per rivestire i pozzetti. Da 12 a 20 ore dopo, utilizzare un microscopio per verificare la formazione di un monostrato uniforme di NET privi di cellule sul fondo dei pozzetti. Una volta verificato il monostrato, aspirare delicatamente tutto il materiale non aderente dai pozzetti, facendo attenzione a non rompere il monostrato sul fondo.
Questo è l'aspetto più impegnativo di questa procedura. Per mantenere un adeguato monostrato NET, è necessario maneggiare la lastra con molta attenzione. Aggiungere lentamente tutti i reagenti e le cellule sul lato dei pozzetti. Aspirare molto delicatamente ed evitare di toccare il fondo del pozzetto con la punta di aspirazione.
Con il materiale non aderente rimosso, aggiungere delicatamente 100 microlitri di una soluzione bloccante dell'albumina sierica bovina all'1% in ciascun pozzetto e lasciare agire per un'ora a temperatura ambiente. Non agitare o scuotere la piastra in quanto ciò potrebbe interrompere il monostrato NET.
Successivamente, preparare le cellule tumorali A549 raccogliendole quando sono confluenti al 70-80% utilizzando tecniche standard. Risospendere le cellule in terreno ad una concentrazione di 2 x 104 cellule per 100 microlitri. Colorare le cellule aggiungendo un microlitro di CFSE per millilitro di terreno e lasciarle a temperatura ambiente per 10 minuti.
Quindi, centrifugare le celle a 450 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel volume iniziale del terreno per mantenere una concentrazione di 2 x 104 cellule tumorali per 100 microlitri di terreno.
Prendere la piastra rivestita in NET e aspirare delicatamente la soluzione bloccante. Quindi, aggiungere 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali a ciascun pozzetto e lasciare che le cellule aderiscano alla piastra per 90 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Aspirare completamente il liquido e aggiungere 1.000 unità di DNasi I ad alcuni pozzetti per 10 minuti per degradare i NET. In altri pozzi, aggiungere 100 microlitri di acqua sterile per pozzetto per 10 minuti come controllo del veicolo. Successivamente, aspirare delicatamente il liquido da ciascun pozzetto e lavare con 100 microlitri di PBS per rimuovere eventuali cellule A549 non aderenti.
Aspirare e scartare tutta la soluzione nei pozzetti, lasciando sul fondo solo i NET e le cellule tumorali aderenti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di una soluzione di formaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule. Trasferire immediatamente la piastra su un microscopio a fluorescenza per leggere il saggio, quindi tracciare e analizzare i risultati utilizzando il software di analisi dei dati.