JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:40 min • July 8th, 2025
Prendere le cellule leucemiche nei terreni di crescita senza fattori stimolanti come le citochine e incubarle.
L'assenza di fattori stimolanti consente alle proteine fosforilate intracellulari di subire la defosforilazione e di tornare al loro stato originario.
Centrifugare e rimuovere il supporto. Risospendere le cellule nel surnatante dello stroma contenente la citochina, la linfopoietina stromale timica o TSLP.
Il TSLP si lega al suo recettore sulla cellula leucemica, innescando la dimerizzazione del recettore.
Questo avvicina le due chinasi associate a Giano Giano, o JAK, facilitando la mutua transfosforilazione.
I JAK attivati fosforilano le code citoplasmatiche del recettore, creando siti di aggancio per il trasduttore di segnale e l'attivatore della trascrizione, monomeri STAT.
Una volta fosforilate, le STAT si dimerizzano e si staccano dal recettore per regolare i processi cellulari a valle.
Fissare le cellule per mantenere gli stati di fosforilazione delle proteine intracellulari.
Trattare le cellule con una soluzione di permeabilizzazione per aumentare la permeabilità della membrana cellulare.
Aggiungere anticorpi marcati in fluorescenza per marcare le proteine fosforilate.
La misurazione citofluorimetrica del segnale di fluorescenza è correlata alla fosforilazione STAT indotta da TSLP.
Per convalidare il surnatante prodotto dallo stroma ingegnerizzato, scongelare i campioni di surnatante raccolti dal controllo nello stroma che esprime citochine e piastrare 3 pozzetti di linee cellulari leucemiche per condizione in terreno R20 a una concentrazione di 2 volte 10 al quinto pozzetto per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Incubare le cellule per due ore a 37 gradi Celsius per consentire la perdita della fosforilazione della coltura precedente.
Quindi, trasferire le cellule da ciascun pozzetto in singole provette da 4 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere i pellet in 600 microlitri per condizione sperimentale e piastrare 200 microlitri di cellule per pozzetto per ogni condizione in triplicato. Incubare le cellule per il periodo appropriato secondo lo specifico dosaggio fosfo-acido commerciale.
Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione ed etichettare le cellule mediante colorazione con citometria a fosfoflusso secondo il protocollo del produttore. Quindi, analizzare le cellule mediante citometria a flusso utilizzando protocolli standard di analisi citofluorimetrica per verificare che la citochina nel surnatante dello stroma fosforila le cellule leucemiche.