Visualizzazione dei batteri nelle sezioni di biopsia vescicale tramite ibridazione in situ a fluorescenza

Inizia con un vetrino che trasporta una sezione di tessuto bioptico della vescica urinaria infetta deparaffinizzata e reidratata contenente batteri uropatogeni.

Introdurre sonde universali marcate in fluorescenza, un oligonucleotide complementare a singolo filamento specifico per la regione conservata dell'RNA ribosomiale batterico 16s, o 16s-rRNA.

Incubare il vetrino al buio a una temperatura elevata per un'ibridazione ottimale.

Durante l'incubazione, le sonde si ibridano esclusivamente nella regione conservata sul 16s-rRNA batterico, conferendo fluorescenza verde ai batteri.

Dopo l'ibridazione, lavare con un tampone preriscaldato per rimuovere le sonde non legate.

Colorare la sezione di tessuto con colorante Hoechst e marcatori proteici cellulari marcati con fluoroforo.

Le molecole di Hoechst si legano al DNA, colorando i nuclei di blu, mentre i marcatori marcati con fluorofori interagiscono con componenti cellulari specifici come la mucina e i filamenti di actina, conferendo fluorescenza rossa nella sezione bioptica.

Lavare il vetrino e aggiungere il supporto di montaggio alla sezione di tessuto.

Al microscopio confocale, la fluorescenza verde all'interno della sezione bioptica della vescica che trasporta la fluorescenza rossa conferma i batteri associati ai tessuti.

Preparare una camera di umidificazione per ogni sonda aggiungendo una salvietta imbevuta, accartocciata e delicata e acqua sterile al serbatoio di una scatola di puntali P1000. Posizionare la cartuccia del supporto della punta sulla parte superiore, poiché è qui che si posizioneranno le diapositive. Al termine del lavaggio finale, rimuovere il vetrino dalla griglia per vetrini e posizionarli su un tovagliolo di carta fresco, con il fazzoletto rivolto verso l'alto. Utilizzare una salvietta delicata per asciugare il vetrino, facendo attenzione a tamponare delicatamente solo vicino ma non sulla sezione della biopsia per allontanare l'acqua. Utilizzando una penna idrofoba, tracciare un bordo attorno alla sezione della biopsia e posizionare il vetrino con il lato del tessuto rivolto verso l'alto nella camera di umidificazione.

Quindi, posizionare la camera di umidificazione in un'incubatrice impostata a 50 gradi Celsius. Pipettare tra 50 e 150 microlitri di soluzione colorante direttamente sopra il fazzoletto in modo che il rettangolo formato dal bordo idrofobico attorno al fazzoletto sia riempito e chiudere delicatamente la scatola. Incubare per una notte a 50 gradi Celsius al buio. Se l'incubatrice ha una finestra, coprila con un foglio di alluminio per creare un ambiente buio.

La mattina successiva, rimuovere i vetrini dalle camere di umidificazione e rimuovere rapidamente la soluzione di ibridazione rimanente con una delicata salvietta. Quindi, posizionare i vetrini in una rastrelliera verticale per la colorazione. Posizionare lo scolapasta in un barattolo di alluminio avvolto in un foglio di alluminio contenente 100 ml di tampone di lavaggio preriscaldato per 10 minuti. Ripetere questa fase di lavaggio altre due volte con un tampone di lavaggio fresco in nuovi barattoli Coplin.

Durante queste fasi di lavaggio, preparare il colorante di contrasto diluendo una soluzione madre di Hoechst 33342 in tampone di lavaggio in un rapporto da 1 a 1.000. Allo stesso tubo, aggiungi l'agglutinina del germe di grano Alexa-555 a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e la falloidina Alexa-555 a una concentrazione finale di 33 nanomolari. Conservare al buio fino al momento dell'uso.

Al termine del lavaggio finale, rimuovere i vetrini dal barattolo Coplin e rimuovere delicatamente il tampone di lavaggio in eccesso con una salvietta delicata. Posizionare i vetrini con il fazzoletto rivolto verso l'alto su un tovagliolo di carta e aggiungere tra i 50 e i 150 microlitri di colorante di contrasto direttamente sopra il fazzoletto in modo che il bordo idrofobico sia riempito ma non traboccante. Coprire fino a quattro vetrini con una parte superiore della crioscatola e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Successivamente, riposizionare i vetrini nel rack di colorazione e lavarli altre due volte in barattoli di coplin contenenti tampone di lavaggio fresco, con ogni lavaggio della durata di 10 minuti. Quindi, asciugare accuratamente i vetrini e posizionarli con il fazzoletto rivolto verso l'alto su un tovagliolo di carta sotto la parte superiore di una crioscatola. Spremere una goccia di supporto di montaggio direttamente sopra il fazzoletto e posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti di dimensioni adeguate. Delicatamente, premere per eliminare le bolle e lasciare che i vetrini scivolati si induriscano durante la notte al buio. Il giorno successivo, sigillare i bordi dei vetrini coprioggetti sul vetrino con un leggero strato di smalto trasparente e lasciare asciugare al buio per 10 minuti, prima di riporli al buio a 4 gradi Celsius.

Quando si è pronti per l'imaging delle biopsie colorate, accendere il microscopio confocale e il software associato al microscopio. Inizia con una diapositiva positiva FISH e passa alla modalità di visualizzazione computerizzata. Selezionare i canali per 405, 488 e 555. Impostare il foro stenopeico utilizzando il canale di lunghezza d'onda più lungo, che in questo caso è 555. Quindi, trova il piano focale corrente per la visualizzazione dei batteri marcati nel canale 488. Senza modificare il piano focale, impostare il guadagno, la potenza del laser e l'offset per ciascun canale, in modo tale che il segnale non sia saturo e lo sfondo non sia eccessivamente corretto. Acquisisci l'immagine in tutti e tre i canali.