JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:54 min • July 8th, 2025
Prendi una sospensione di cellule Jurkat - cellule leucemiche dei linfociti T.
Mescolare un'aliquota con un colorante per la vitalità cellulare e garantire un numero adeguato di cellule viventi.
Placcare le cellule in un piatto di coltura e applicare radiazioni ultraviolette C o UVC per la durata richiesta.
Gli UVC penetrano nelle cellule e vengono assorbiti dal DNA, formando fotoprodotti pirimidinici.
Dopo l'irradiazione, incubare le cellule. Un esteso danno al DNA mediato da UVC avvia la via intrinseca dell'apoptosi, attivando le proteine pro-apoptotiche sulla membrana mitocondriale esterna.
Le proteine attivate oligomerizzano, formando i pori della membrana e rilasciando il citocromo C dallo spazio intermembrana nel citoplasma.
Il citocromo C si complessa con il fattore di attivazione della proteasi apoptotica-1, formando un complesso apoptosomia. L'apoptosoma attiva le caspasi, causando l'apoptosi.
Introdurre l'annessina V marcata con fluoroforo per marcare la fosfatidilserina sulla membrana, un marcatore cellulare apoptotico, e aggiungere ioduro di propidio che entra attraverso la membrana danneggiata per marcare il DNA.
Utilizzando la citometria a flusso, determinare le cellule apoptotiche precoci marcate con annessina V e le cellule apoptotiche tardive a doppia colorazione.
Inizia coltivando le cellule T Jurkat in terreno di coltura cellulare basale, integrate secondo le indicazioni del manoscritto, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Le cellule T Jurkat sono una linea cellulare in sospensione che può essere mantenuta attraverso il passaggio in terreni di coltura preriscaldati ogni tre giorni.
Prepara le cellule apoptotiche facendole crescere fino al 90% di confluenza, che richiede da tre a quattro giorni dopo il passaggio. Far crescere le cellule in cinque fiasche T75, per ottenere un numero sufficiente di cellule per questo protocollo. Una volta che le cellule sono pronte, aspirare il contenuto del pallone per circa 24 millilitri e trasferirlo in una provetta conica da 50 millilitri. Contare le cellule utilizzando la colorazione con blu di tripano e un emocitometro.
Pellettare le celle mediante centrifugazione a 271 volte g per cinque minuti e scartare il surnatante. Quindi, risospendere le cellule nel terreno per ottenere tre milioni di cellule per millilitro. Aliquotare le cellule in piastre di coltura tissutale da 100 x 20 millimetri trasferendo cinque millilitri di cellule per piastra.
Prepara circa nove piatti di cultura. Metti da parte un piatto come controllo non esposto ed esponi i piatti rimanenti ai raggi UV. Impostare il reticolante UV sul livello di energia corretto premendo il pulsante dell'energia e inserendo "600" con il tastierino numerico. Irradiare tutte le piastre con le cellule ad eccezione del controllo, assicurandosi di rimuovere il coperchio superiore della piastra di coltura tissutale durante l'esposizione ai raggi UV.
Quindi, incubare tutte le piastre in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per quattro ore. Dopo l'incubazione, unire tutte le cellule irradiate in una provetta conica da 50 millilitri e pellettare mediante centrifugazione a 271 volte g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 24 millilitri di PBS sterile. Centrifugare nuovamente la provetta e rimuovere il surnatante.