Analisi dell'attivazione dei basofili in presenza di un allergene del test mediante citometria a flusso

Prendere le provette del citometro contenenti una miscela colorante composta da anticorpi monoclonali marcati in fluorescenza sospesi in un tampone di stimolazione.

Aggiungere concentrazioni decrescenti dell'allergene del test in diverse provette. Aggiungere anticorpi anti-IgE a una provetta per fungere da controllo positivo IgE-mediato e aggiungere tampone a un'altra provetta per il controllo negativo.

Pipettare il sangue periferico umano nelle provette. Incubare.

Se l'individuo è sensibilizzato all'allergene del test, questa esposizione fa sì che l'allergene si leghi agli anticorpi IgE allergene-specifici legati ai recettori Fc sulla superficie del basofilo.

Gli allergeni reticolano i recettori FC legati alle IgE, causando l'attivazione dei basofili.

I basofili subiscono degranulazione, rilasciando granuli intracellulari contenenti mediatori dell'infiammazione, con l'upregolazione delle molecole CD63 e CD203c.

Gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza si legano rispettivamente a CD63, CD203c e CCR3 sui basofili.

Abbassare la temperatura per fermare la degranulazione dei basofili.

Aggiungere un tampone per lisi gli eritrociti e fissare le cellule.

Utilizzando un citometro a flusso, identificare i basofili dalla popolazione linfocitaria.

Utilizzando CD63 come marcatore di attivazione, analizzare l'attivazione dei basofili a concentrazioni decrescenti di allergeni.

Iniziare raccogliendo il sangue periferico in provette eparinizzate da 9 millilitri e posizionare i campioni in un rotore per mantenerli a temperatura ambiente fino a quando non sono necessari per il protocollo sperimentale.

Etichettare due provette citometriche da 5 millilitri ciascuna per il controllo negativo e il controllo positivo. Inoltre, etichettare una provetta per le diverse concentrazioni di allergeni o farmaci da testare. Quindi, posizionare le provette in una rastrelliera in modo che si adattino perfettamente senza scivolare.

Per il primo controllo positivo, preparare una soluzione di 4 micromolari di N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina, o fMLP, in PBST allo 0,05% per confermare la qualità dei basofili. Per il secondo controllo positivo, preparare una soluzione anti-IgE da 0,05 milligrammi per millilitro utilizzando PBST. Preparare la miscela colorante aggiungendo 1 microlitro ciascuno di anticorpi CCR3-APC, CD203c-PE e CD63-FITC per 20 microlitri di tampone di stimolazione. Quindi, aggiungere 23 microlitri di questa miscela colorante a ciascun tubo.

Aggiungere 100 microlitri di PBST alle provette di controllo negativo, aggiungere 100 microlitri di fMLP a una delle provette di controllo positivo e aggiungere 100 microlitri di anti-IgE all'altra. Al resto delle provette, aggiungere 100 microlitri delle diverse concentrazioni di allergeni o farmaci e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 100 microlitri di sangue a ciascuna provetta per evitare l'emolisi. Quindi, agitare delicatamente le provette e incubarle per 25 minuti a 37 gradi Celsius nel bagno termostatico con agitazione media.

Tenere i tubi a 4 gradi Celsius per almeno cinque minuti per fermare la degranulazione. Ad ogni provetta, aggiungere 2 millilitri di tampone lisanti per lisare gli eritrociti. Agitare ogni provetta, quindi incubare le provette per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare le provette a 300 x g a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi, capovolgere il rack nel lavandino per travasare il surnatante mentre le celle rimangono sul fondo delle provette. Aggiungere 3 millilitri di PBST a ciascuna provetta per lavare le cellule e agitare le provette. Eseguire un secondo ciclo di centrifugazione utilizzando lo stesso set di parametri e decantare il surnatante capovolgendo la griglia nel lavandino. Quindi, conservare i campioni a 4 gradi Celsius, al riparo dalla luce fino alla citometria a flusso.

Collegare il citometro a flusso al software del computer e attendere che il citometro sia pronto. Caricare il modello e le impostazioni dello strumento come descritto nel manoscritto del testo. Avviare il processo di acquisizione del campione.

Per selezionare i basofili attivati, per prima cosa, prendi i linfociti dal grafico Side Scatter - Forward Scatter. Quindi prendi i basofili dalla popolazione linfocitaria come cellule CD203c-positive CCR3-positive e acquisisci almeno 500 basofili per provetta. Impostare la soglia negativa del CD63 a circa il 2,5% utilizzando le provette di controllo negative e analizzare i campioni.