Tracciamento dei leucociti basato sulla fotoconversione in zebrafish transgenico infetto da batteri

Inizia con un piatto contenente larve di pesce zebra transgenico anestetizzate e incorporate nell'agarosio che esprimono la proteina fluorescente fotoconvertibile nei loro leucociti, le cellule immunitarie fagocitiche.

La vescicola otica sinistra, pre-iniettata con batteri marcati con colorante fluorescente rosso, è posizionata in piano contro il fondo della piastra.

All'interno della vescicola otica, i batteri pre-iniettati causano un'infezione locale, innescando la migrazione delle cellule immunitarie e il rilascio di chemochine, causando l'infiltrazione di leucociti nella vescicola otica.

Al microscopio a fluorescenza, osservare il reclutamento iniziale dei leucociti verdi e la fagocitosi dei batteri rossi da parte dei leucociti nel sito di infezione.

Illumina la vescicola otica con una lunghezza d'onda di 405 nanometri, trasformando irreversibilmente la proteina fluorescente fotoconvertibile da verde a rossa e impartendo fluorescenza rossa ai leucociti, consentendo la loro visualizzazione distinta e il tracciamento preciso.

Ora, esamina le larve a due diverse lunghezze d'onda a varie profondità, consentendo la visualizzazione sia dei leucociti a fluorescenza rossi fotoconvertiti che dei restanti leucociti a fluorescenza verdi.

I leucociti rossi fotoconvertiti si disperdono dalle vescicole otiche e si disperdono in tutto il corpo, facilitando il tracciamento dei leucociti basato sulla fotoconversione.

Dopo aver preparato l'agarosio con la tricaina secondo il protocollo di testo sul tavolino dello stereomicroscopio, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare da quattro a cinque larve anestetizzate in un piatto con fondo di vetro. Togliete la soluzione di tricaina e agarosio dal bagnomaria a 55 gradi Celsius e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente per 1 o 2 minuti.

Nel frattempo, rimuovere quanto più liquido possibile dalle larve anestetizzate. Successivamente, versare l'agarosio raffreddato nella pirofila fino a coprire circa metà della superficie. Quindi, agitare il piatto per spalmare l'agarosio. Raccogli le larve che hanno galleggiato ai lati del piatto e pipettale di nuovo al centro. Quindi, sotto lo stereomicroscopio, utilizzare una lunga punta della pipetta per posizionare delicatamente le larve come desiderato.

Per l'imaging della vescicola otica, posizionare le larve in modo che la vescicola otica destra sia rivolta verso l'alto e la vescicola otica sinistra sia piatta contro il fondo della piastra. Lasciate raffreddare l'agarosio per circa 10 minuti prima di spostare il piatto. Quindi, pipetta delicatamente un po' di tricaina e una soluzione di E3 sopra lo strato di agarosio per mantenerlo umido.

Per visualizzare i campioni, utilizzare una scansione z-stack con laser a 488 nanometri e 543 nanometri. Utilizzare la scansione a linea continua per regolare la potenza del laser e il guadagno del rivelatore. Verificare che non vi sia fluorescenza rossa fotoconvertita accidentalmente. Nella finestra " Controllo acquisizione immagini", in "Impostazioni stimolo", selezionare lo strumento "Usa scanner" e scegliere "Principale". Seleziona il laser a 405 nanometri e impostalo al 70% di potenza. Quindi, utilizzando l'opzione cerchio, definire la regione di interesse nella vescicola otica.

Nell'impostazione "Inizio stimolo ", seleziona "Attivazione in serie" con una preattivazione di 1 fotogramma e un tempo di attivazione di 60.000 millisecondi. Nella finestra "Impostazioni di acquisizione", sotto l'intestazione "Scansione tempo", scegli due intervalli di minuti, ciascuno per la conversione pre e uno per la conversione post-foto. Avvia la serie time-lapse per avviare la fotoconversione della regione di interesse definita. Infine, scansiona il campione utilizzando uno z-stack e i laser a 488 e 543 nanometri per visualizzare la fluorescenza rossa fotoconvertita e l'eventuale fluorescenza verde rimanente.