JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:43 min • July 8th, 2025
Prendi una provetta contenente sangue umano appena prelevato e aggiungi un tampone di lisi.
Il detergente nel tampone permeabilizza la membrana cellulare, lisando le cellule e rilasciando acidi nucleici intracellulari, o NA, e nucleasi.
Gli agenti caotropici nel tampone denaturano le nucleasi, impedendo la degradazione di NA.
Aggiungere particelle di vetro magnetiche o MGP - particelle magnetiche rivestite di silice - e mescolare accuratamente.
Il basso pH del tampone protona la silice, producendo una carica positiva sulla superficie degli MGP.
I NA caricati negativamente si legano elettrostaticamente alla superficie carica, formando un complesso NA-MGP.
Sotto un campo magnetico, i complessi NA-MGP si raccolgono sul lato del tubo.
Scartare il surnatante contenente detriti cellulari e proteine.
Eseguire più fasi di lavaggio risospendendo i complessi NA-MGP in un tampone di lavaggio, applicando un campo magnetico per raccogliere i complessi e scartando il surnatante con i contaminanti rimanenti.
Risospendere i complessi in un tampone di eluizione. L'alto pH interrompe l'interazione NA-MGP, rilasciando gli NA. Gli NA eluiti sono pronti per i saggi a valle.
Per purificare gli acidi nucleici dal sangue raccolto, mescolare nuovamente il contenuto della provetta capovolgendo manualmente la provetta a vuoto da 5 a 10 volte. Versare l'aliquota preparata di MGP direttamente nella provetta per la raccolta del sangue, quindi posizionare un nuovo coperchio da una provetta per la raccolta del sangue non utilizzata sulla provetta contenente il campione. Metti un dito sul coperchio per assicurarti che il tubo sia ben chiuso e mescola il contenuto del tubo girandolo da 5 a 10 volte.
Posizionare il tubo nel supporto magnetico e tenere un dito sul coperchio per assicurarsi che il tubo sia ben chiuso. Quindi, capovolgere il supporto magnetico con il tubo alcune volte per disperdere gli MGP prima che si raccolgano sul lato del tubo con il magnete. Rimuovere il coperchio della provetta ed eliminare il contenuto della provetta in una provetta di raccolta da 50 millilitri utilizzando una pipetta monouso.
Versare l'aliquota preparata di WB1 direttamente nella provetta per il prelievo del sangue e chiudere il coperchio della provetta. Mescola il contenuto a mano da 5 a 10 volte. Quindi, raccogli le perline sul lato del tubo usando il magnete e rimuovi il liquido come prima. Risospendere le perle nell'aliquota preparata di WB2. Quindi, scartare la soluzione e ripetere la procedura con l'aliquota preparata di WB3.
Infine, rimuovere la provetta dal supporto magnetico e versare l'aliquota di EB preparata direttamente nella provetta per il prelievo del sangue. Posizionare il coperchio sul tubo e risospendere gli MGP picchiettando da 5 a 10 volte con un dito. Infine, utilizzare una pipetta monouso da 1,5 millilitri per trasferire una gocciolina di MGP risospesi nella miscela di reazione di amplificazione dell'acido nucleico a valle.