Misurazione dell'esocitosi dei mastociti tramite il rilascio di proteine fluorescenti rosse monomeriche del neuropeptide Y

Prendiamo i mastociti trasfettati che esprimono NPY-mRFP, una proteina di fusione contenente il neuropeptide Y e la proteina fluorescente rossa monomerica, nei loro granuli secretori citoplasmatici.

Rimuovere il supporto. Pipettare il tampone contenente calcio con un reagente attivante, uno ionoforo di calcio, e incubare.

Questi ionofori inducono l'afflusso di calcio, aumentando la concentrazione intracellulare di calcio e mobilizzando i granuli secretori sulla membrana plasmatica.

Il calcio si lega alle proteine leganti il calcio sulla membrana del granulo secretorio.

Inoltre, i granuli secretori si fondono con la membrana plasmatica mediata da proteine legate alla membrana, con conseguente esocitosi e rilascio di contenuti, tra cui NPY-mRFP.

Dopo l'incubazione, raccogliere e trasferire il surnatante contenente NPY-mRFP rilasciato su una piastra nera a più pozzetti.

Aggiungere un detergente non ionico per lisare le cellule e rilasciare l'NPY-mRFP intracellulare rimanente.

Raccogliere e trasferire il lisato cellulare sulla piastra a più pozzetti.

Utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, misurare la fluorescenza del surnatante cellulare e del lisato per quantificare la perc