Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

Preparare un vetrino da camera con un doppio strato lipidico supportato, o SLB, composto da fosfolipidi e fosfolipidi biotinilati.

Aggiungi proteine bloccanti per prevenire interazioni non specifiche.

Introdurre la streptavidina, che si lega ai fosfolipidi biotinilati.

Aggiungere anticorpi anti-CD16 biotinilati marcati con fluorescenza, che si legano alla streptavidina immobilizzata.

Pipettare la D-biotina per prevenire il legame non specifico della streptavidina alle cellule.

Introdurre le cellule natural killer, o NK. I recettori CD16 su queste cellule si legano specificamente agli anticorpi anti-CD16 legati a SLB, formando una sinapsi immunologica.

Questo legame innesca il riarrangiamento dell'actina e la polarizzazione dei microtubuli, formando infine microcluster al centro della sinapsi contenenti anticorpi anti-CD16 legati a SLB e recettori CD16.

I granuli litici contenenti perforina si polarizzano e penetrano attraverso i filamenti di actina nella sinapsi.

Correggi le celle. Permeabilizzare le membrane e SLB.

Aggiungere la falloidina marcata in fluorescenza e gli anticorpi anti-perforina, che si legano rispettivamente ai filamenti di actina e alla perforina.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza a super risoluzione, visualizza la distribuzione dei filamenti fluorescenti di actina e dei granuli perforin-positivi alla sinapsi.

Per assemblare il doppio strato lipidico planare supportato da vetro, per prima cosa, preparare 100 millilitri di soluzione piranha mescolando perossido di idrogeno al 30% con acido solforico in un rapporto di 1 a 3 in un becher. In questa soluzione, posizionare due vetrini coprioggetti rettangolari #1.5 per 20-30 minuti. Durante la pulizia dei vetrini, recuperare una provetta di lipidi DOPC da 400 micromolari precedentemente preparati e una provetta di lipidi Biotin-PE da 80 micromolari precedentemente preparati. Trasportali sul ghiaccio al serbatoio dell'argon.

Dopo aver deossigenato una nuova provetta da microcentrifuga con argon, aggiungere il DOPC e la Biotina-PE in un rapporto di 1 a 1. Il volume specifico varierà in base alle esigenze sperimentali, ma dovrebbe essere, come minimo, di 2 microlitri ciascuno. Deossigenare la provetta della miscela e le singole provette dei reagenti prima di rimettere queste ultime in frigorifero.

Al termine della pulizia, sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti con acqua distillata. Metti i vetrini coprioggetti ad asciugare all'aria per alcuni minuti. Quindi, prelevare 1,5 microlitri della miscela di liposomi e aliquotarla in una singola goccia in una delle camere di corsia di un vetrino. L'uso di due drop per corsia è tipico ma non necessario.

Ora, posiziona in modo rapido ed efficiente il vetrino coprioggetti asciutto sulle goccioline. Assicurarsi che le gocce siano sufficientemente distanziate in modo che non si uniscano una volta posizionato il vetrino coprioggetti. Inoltre, assicurarsi che le gocce rimangano circolari e ben definite, senza toccare i bordi delle pareti della camera. Premere con decisione, tra e intorno a ciascuna corsia, per garantire una tenuta stagna tra il vetrino coprioggetti e il vetrino.

Segna le posizioni delle gocce usando un pennarello. Quindi, passare 100 microlitri di caseina acquosa al 5% attraverso la camera per bloccare il doppio strato. Cercare di assicurarsi che non ci siano bolle nella camera di flusso. Quindi, iniettare 100 microlitri di streptavidina a una concentrazione di 333 nanogrammi per millilitro in ciascuna corsia.

Dopo l'incubazione per 10-15 minuti a temperatura ambiente, lavare facendo scorrere 3 millilitri di soluzione salina tamponata con HEPES con albumina sierica umana all'1% attraverso ciascuna corsia per rimuovere la streptavidina in eccesso. Aggiungere 100 microlitri di anti-CD16 biotinilato marcato in fluorescenza alla concentrazione proteica precedentemente determinata, come descritto nel protocollo di testo.

Dopo l'incubazione al buio per 20-30 minuti, lavare nuovamente facendo scorrere 3 millilitri di soluzione salina tamponata con HEPES con albumina sierica umana all'1% attraverso ciascuna corsia. Quindi, far scorrere 100 microlitri di D D-biotina a una concentrazione di 25 nanomolari attraverso la camera per legare l'eccesso di streptavidina e, quindi, eliminare la possibilità di legame non specifico della streptavidina alle cellule.

Successivamente, contare le cellule NK umane e risospenderle a una concentrazione di 500.000 per millilitro in soluzione salina tamponata con HEPES con albumina sierica umana all'1%. Lavare la D-biotina fuori dalla camera con altri 3 millilitri di soluzione salina tamponata con HEPES con l'1% di albumina sierica umana per corsia. Una volta che le cellule sono state risospese alla concentrazione desiderata, aggiungere 100 microlitri a ciascuna corsia. Posizionare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al 5% per 30-60 minuti.

Trascorso questo periodo di incubazione, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 10-20 minuti. Lavare facendo scorrere 3 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato su ciascuna corsia per rimuovere la paraformaldeide. Quindi, aggiungere 400 microlitri di tampone bloccante prima di incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Successivamente, colorare la F-actina e la perforina aggiungendo 200 microlitri di falloidina diluita e marcata in fluorescenza e anticorpo monoclonale anti-perforina marcata in fluorescenza. Incubare a temperatura ambiente per un'ora prima del lavaggio facendo scorrere 3 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato attraverso la camera. La camera è pronta per l'imaging.

Per iniziare, accendi tutti i moduli hardware necessari del microscopio STED. Avviare il software di analisi delle immagini e abilitare sia la scansione risonante che i moduli STED. Dopo aver effettuato queste selezioni, attendere circa tre-cinque minuti per l'avvio del software.

Fare clic sulla scheda Configurazione nella parte superiore dello schermo. Selezionare Configurazione laser. Quindi, accendi la luce bianca e i laser STED a 592 nanometri. Scegli l'obiettivo 100X e allinea il raggio laser di eccitazione con un laser a deplezione a 592 nanometri. Selezionare il modulo Laser Config. Spegni il laser di esaurimento 592 e accendi il laser di esaurimento a 660 nanometri.

Posizionare il vetrino sul tavolino sopra l'obiettivo. Mettere a fuoco le cellule legate sulla regione delimitata del doppio strato utilizzando la lampada a luce bianca e gli oculari. Quindi, torna alla scheda Acquisizione direttamente a destra della scheda Configurazione. Fare clic sulla scheda Passa a luce bianca, quindi accendere il modulo e trascinare la linea laser di eccitazione sulla lunghezza d'onda appropriata.

Dopo aver selezionato il rilevatore desiderato e impostato l'intervallo di rilevamento, fare clic sul pulsante Sequenziale nella barra degli strumenti di acquisizione a sinistra per visualizzare la finestra di dialogo di scansione sequenziale nella parte inferiore della barra degli strumenti a sinistra. Ciò consente all'utente di aggiungere più sequenze, ognuna con un raggio di eccitazione diverso per un colore diverso. Fare clic tra i fotogrammi, quindi impostare la frequenza di eccitazione, il rilevatore e l'intervallo di rilevamento per ogni colore aggiuntivo. Una volta ottimizzate tutte le impostazioni, premi Avvia per iniziare il processo di acquisizione.