JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:26 min • July 8th, 2025
Inizia con un polmone umano resecato.
Inserire un tubo di silicone nel bronco principale del polmone. Fissare il tubo, fornendo un percorso per l'introduzione dell'agarosio nel tessuto nelle fasi successive.
Clamp altri bronchi e vasi per evitare perdite di agarosio durante il riempimento.
Introdurre nel polmone l'agarosio preriscaldato a basso gelificamento mescolato con terreno fino a quando non è completamente gonfiato.
Posizionare il polmone su ghiaccio per la polimerizzazione dell'agarosio, formando una matrice di gel solido che fornisce stabilità al tessuto e mantiene l'architettura polmonare durante le procedure di sezionamento.
Dopo la polimerizzazione, tagliare il tessuto polmonare in lastre uniformi. Estrarre nuclei di tessuto cilindrici dalle lastre di tessuto.
Utilizzando un'affettatrice riempita con tampone refrigerato, affettare il nucleo del tessuto per ottenere fette di polmone tagliate con precisione.
Trasferire le fette in una piastra di coltura contenente terreno refrigerato. Incubare per stabilizzare il tessuto.
Infine, trasferire le fette in una piastra a più pozzetti contenente il terreno. Le fette di polmone preparate e tagliate con precisione sono ora pronte per gli esperimenti.
Per iniziare questa procedura, cannulare la trachea inserendo il tubo di silicone e fissandolo con una pinza parallela al tubo in modo che la pinza stringa il tessuto insieme al tubo di silicone senza pizzicarlo. Chiudere tutti gli altri bronchi, vasi sanguigni e lesioni con le pinze in modo che l'agarosio non possa fuoriuscire durante la procedura di riempimento.
Per incannulare il bronco principale sono necessarie buone capacità anatomiche. I polmoni non devono essere dilatati troppo, altrimenti il tessuto si distrarrà e, se il tessuto non è riempito abbastanza, sarà impossibile fare qualsiasi PCLS perché il tessuto è troppo morbido.
Quindi, mescolare un volume equivalente di agarosio a bassa gelificazione al 3% con il terreno di coltura in un becher e instillare la miscela nel polmone utilizzando una siringa da 50 millilitri. Prima di riempire nuovamente la siringa con il fluido, chiudere il catetere con le dita o con una pinza per evitare bolle d'aria e flusso privo di agarosio. Tagliare il tessuto polmonare in lastre da 3 a 5 centimetri.
Riempire l'affettatrice con 400 millilitri di EBSS ghiacciato. Immediatamente, tagliare i nuclei cilindrici di tessuto dalle lastre polmonari utilizzando un cacciavite semiautomatico con uno strumento di carotaggio. Successivamente, trasferire i nuclei di tessuto nel supporto per fazzoletti dell'affettatrice. Posiziona il peso sopra il nucleo del tessuto e inizia a tagliare il nucleo del tessuto in PCLS. Il terreno deve essere drenato dall'affettatrice in un becher aprendo la fascetta del cilindro di vetro.
Quindi, trasferire le fette da un becher alla piastra di Petri con terreno di coltura. Successivamente, posizionare la capsula di Petri in un'incubatrice e lasciare che il terreno si riscaldi prima delle fasi di lavaggio. Quindi, trasferire con cura le fette di polmone in una piastra di coltura a 24 pozzetti con un minimo di 500 microlitri di terreno di coltura per due fette per pozzetto.