JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:10 min. • July 8th, 2025
Prelevare una piastra multipozzetto contenente fette di polmone umano tagliate con precisione, che mantengono la microarchitettura polmonare nativa.
Rimuovi i supporti. Aggiungere concentrazioni crescenti di agente di prova ai pozzetti e incubare.
A seconda del suo potenziale citotossico, l'agente in esame distrugge le membrane cellulari, inducendo la morte cellulare e riducendo le cellule vitali all'interno delle fette.
Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno. Immergere le fette in un terreno contenente sale di tetrazolio solubile in acqua, o WST-1, e un reagente di accoppiamento elettrone.
incubare. Nelle cellule metabolicamente attive, il sistema di trasporto degli elettroni della membrana plasmatica trasferisce gli elettroni dal NADH intracellulare al reagente di accoppiamento elettronico extracellulare, riducendo il colorante impermeabile alle cellule WST-1 a formazano stabile, giallo scuro e solubile in acqua.
Dopo l'incubazione, agitare la piastra per distribuire uniformemente il formazan e trasferirlo in una piastra a più pozzetti.
Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza del formazano, indicativa della vitalità tissutale.
Una diminuzione dell'assorbanza del formazan, dipendente dalla concentrazione dell'agente in esame, indica una ridotta vitalità della fetta polmonare, confermando la citotossicità dell'agente in esame.
Per preparare una miscela master della soluzione di lavoro, diluire 25 microlitri di reagente WST-1 e 225 microlitri di terreno per ogni pozzetto. Quindi, pipettare 250 microlitri della soluzione di lavoro master-mix di WST-1 per ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Assicurarsi che il PCLS sia completamente coperto dal reagente WST-1 durante l'incubazione.
Successivamente, posizionare la piastra su un agitatore orbitale a 200 giri/min e agitare accuratamente per 30 secondi per garantire una miscelazione accurata del reagente WST-1. Quindi, pipettare 100 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti in una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti in duplicati. Misurare l'assorbimento di ciascun pozzetto a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre il riferimento di assorbimento a 630 nanometri da quello a 450 nanometri.