JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:34 min. • July 8th, 2025
Prendi un coprioggetto a camera contenente mastociti, cellule immunitarie con granuli secretori, o SG, contenenti mediatori infiammatori.
Aggiungere gli anticorpi IgE insieme a un reporter fluorescente sensibile al pH e incubare.
Gli anticorpi si legano ai recettori Fc sui mastociti. I reporter vengono internalizzati tramite pinocitosi e gli endosomi risultanti si fondono con i SG.
Rimuovere il supporto. Aggiungere un antigene contenente più epitopi leganti le IgE; Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza e applicare la lunghezza d'onda di eccitazione richiesta.
Il pH acido degli SG spegne la fluorescenza del reporter.
L'antigene si lega ai complessi del recettore IgE sulla superficie cellulare, reticolandoli.
L'aggregazione del recettore mediata dall'antigene innesca la migrazione degli SG verso la membrana plasmatica.
Le proteine SNARE sul plasma e sulla membrana SG mediano la fusione della membrana e lo scarico del carico SG, chiamata esocitosi.
L'aumento del pH del mezzo provoca l'alcalinizzazione dell'SG, inducendo i reporter a riacquistare la fluorescenza.
Gli SG in entrata si fondono con quelli fusi a membrana. L'alcalinizzazione del secondo SG media il recupero della fluorescenza, confermando l'esocitosi composta.
Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare a un vetrino coprioggetto con terreno di coltura fresco integrato con FITC-destrano e far crescere le cellule RBL durante la notte. Per prima cosa, prepara una soluzione tampone finale di Tyrode secondo il protocollo di testo. Quindi, prepara un reagente secretagogo 20x nel tampone appena fatto.
Sciogliere la polvere di cloruro di ammonio nel tampone di Tyrode per creare una soluzione di cloruro di ammonio da 400 millimolari. Quindi, aspirare il supporto dal vetro di copertura a camera e sostituirlo con 300 microlitri di tampone di Tyrode preriscaldato. Dopo aver ripetuto il processo di lavaggio due volte, riempire la camera con 300 microlitri di tampone Tyrode.
Quindi, posizionare il vetro di copertura a camera nella camera dell'incubatore di un microscopio e assicurarsi che la camera sia stabile. Accendere la sorgente luminosa fluorescente e selezionare il filtro di fluorescenza appropriato. Una volta che la regione di interesse è a fuoco al centro del campo visivo, spegnere la sorgente luminosa.
Quindi, accendi il laser a 488 nanometri con l'emissione raccolta da 500 a 550 nanometri. Quindi, calibrare l'intervallo di tempo tra le acquisizioni delle immagini. Impostare la direzione di scansione su "Bidirezionale". Non consentire la media. Aprire il foro stenopeico e impostare la risoluzione su 512 x 512.
Quindi, visualizza le cellule per la durata appropriata per il tipo di cellula o secretagogo specifico. Quindi, aggiungere 16 microlitri dalla soluzione secretagoga alla camera e continuare le riprese. Infine, per confermare la presenza e la localizzazione del FITC-destrano nei granuli secretori, aggiungere delicatamente 16 microlitri di soluzione di cloruro di ammonio alla camera.