JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:49 min • July 8th, 2025
Prendi un dispositivo di filtraggio centrifugo di grande volume contenente membrane verticali di cellulosa rigenerata di una dimensione dei pori adeguata.
Aggiungere il tampone e centrifugare. Rimuovere l'umettante di membrana che contiene il flusso.
Caricare il dispositivo con la proteina filtrata di coltura batterica, o CFP, che comprende proteine solubili e vescicole extracellulari, o EV, strutture legate ai lipidi di dimensioni nanometriche contenenti biomolecole secrete dai batteri.
Durante la centrifugazione, il CFP passa tangenzialmente attraverso le membrane tramite la forza centrifuga.
Le biomolecole più piccole dei pori della membrana passano attraverso il fluido di coltura, mentre quelle più grandi, come le vescicole extracellulari, passano sopra la superficie della membrana, riducendo al minimo l'intasamento della membrana.
Il filtro concentra la CFP in un volume minimo del dispositivo, aiutato dal suo volume dead-stop per prevenire l'essiccazione delle biomolecole.
Aggiungere il tampone e centrifugare.
Il tampone sostituisce i componenti residui del terreno, creando un ambiente isotonico per le biomolecole CFP e mantenendone l'integrità.
Posizionare la tazza del concentrato sopra la tazza del filtro, capovolgere e centrifugare. Recuperare il retentato CFP concentrato per ulteriori analisi.
Per iniziare, preparare un filtro centrifugo di taglio del peso molecolare da 100 kilodalton aggiungendo l'intera capacità di volume di PBS. Centrifugare per cinque minuti a 2.800 volte g a 4 gradi Celsius. Scartare il flusso e l'eventuale PBS rimanente e riempire la camera del campione con Mtb CFP fino alla sua capacità massima. Centrifugare a 2.800 volte g a 4 gradi Celsius fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario fino a quando l'intero campione non è stato sufficientemente ridotto.
Aggiungere 1x PBS all'unità filtro contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto in precedenza e ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e la sostituzione del tampone. Quindi, recuperare il retentato CFP concentrato di 100 kilodalton, o 100R, secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione. Lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e tirare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.