Una tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale per purificare le vescicole extracellulari micobatteriche
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:38 min • July 8th, 2025
Prelevare una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale impacchettata con una matrice inerte di particelle di resina polisaccaridica. Le particelle porose hanno una dimensione dei pori definita.
Lavare la colonna con un tampone di equilibratura per una purificazione ottimale.
Aggiungere un filtrato di coltura concentrato elaborato da una coltura di Mycobacterium tuberculosis , un batterio patogeno. Il filtrato contiene vescicole extracellulari, o EV, e altre proteine solubili secrete dai batteri.
Le vescicole extracellulari sono strutture sferiche di dimensioni eterogenee, piccole. Contengono macromolecole e fattori di virulenza racchiusi in un doppio strato lipidico.
Il campione entra nella matrice per gravità. Aggiungere il buffer per consentire lo spostamento del campione attraverso la colonna.
Le vescicole extracellulari non possono entrare nella resina a causa delle piccole dimensioni dei pori e si muovono invece attraverso lo spazio interparticellare, percorrendo un percorso più breve ed eluendo per prime.
Le proteine, avendo una dimensione più piccola, entrano nei pori, percorrono un percorso più lungo attraverso la resina ed eluiscono alla fine.
Raccogli le frazioni contenenti EV per l'analisi a valle.
Lasciare che la cromatografia ad esclusione dimensionale, o colonna SEC, si equilibri a temperatura ambiente. Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità a torre e, se necessario, premere SETUP sul touchscreen del menu principale per regolare le impostazioni della cella di carico. Dalla schermata SETUP, allineare il carosello selezionando CAROUSEL seguito da CALIBRATE. Inserire la giostra con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare la giostra premendo i pulsanti meno o più in modo che l'ugello del fluido si trovi direttamente sopra la posizione di lavaggio.
Rimuovere i cappucci dalla colonna SEC bilanciata e far scorrere la colonna SEC nel supporto della colonna appropriato. Installarlo con cura sulla torre AFC. Assicurarsi che l'etichetta di identificazione a radiofrequenza sulla colonna sia rivolta verso l'AFC e verificare che il collegamento tra la colonna e la valvola sia sicuro. Posizionare il tubo di scarico in un contenitore di raccolta. Dalla schermata SETUP, selezionare Programma di raccolta e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0.5 millilitri premendo i pulsanti meno o più.
Lasciare l'impostazione predefinita del volume del buffer di 2,7 millilitri, quindi chiudere la finestra Pianificazione raccolta. Seleziona Avvia raccolta dalla schermata principale e conferma i parametri di raccolta selezionando Sì. Caricare 13 provette per microcentrifuga da 1,7 millilitri etichettate con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra. Far avanzare l'AFC selezionando OK. Quindi, montare il serbatoio della colonna e avanzare nuovamente premendo OK.
Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo Sì e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato a 0,2 micrometri per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il lavaggio, far avanzare l'AFC premendo OK. Posizionare il coperchio del carosello sull'AFC e premere OK. Utilizzare una pipetta per rimuovere il tampone in eccesso dalla colonna. Portare 3 milligrammi di campione 100R a 500 microlitri con 1x PBS e aggiungere il campione nella parte superiore della colonna.
Preparare un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 micrometri. Far avanzare l'AFC e lasciare che il campione penetri nella fritta. Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato in precedenza al serbatoio. Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume degli spazi vuoti e poi le frazioni specificate. Al termine della corsa e dopo che la giostra è tornata nella posizione di scarto, rimuovere il coperchio e i tubi di frazione dalla giostra.
Panoramica
In questo articolo viene descritto il processo di purificazione di vescicole extracellulari (EV) da Mycobacterium tuberculosis mediante cromatografia di esclusione molecolare (SEC). La metodologia evidenzia la separazione delle vescicole extracellulari dalle proteine solubili in base alla dimensione, facilitando le analisi successive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Chimica biologica
Sfondo
- Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole strutture sferiche secrete dai batteri.
- Mycobacterium tuberculosis è un batterio patogeno noto per i suoi fattori di virulenza.
- La cromatografia di esclusione dimensionale è una tecnica utilizzata per separare le molecole in base alla dimensione.
- Comprendere le EV può fornire informazioni sulla comunicazione batterica e sulla patogenesi.
Scopo dello studio
- Purificare le VEs da Mycobacterium tuberculosis per ulteriori analisi.
- Dimostrare l'efficacia della cromatografia di esclusione dimensionale nella separazione delle VEs da altre proteine.
- Facilitare lo studio del ruolo delle VEs nella virulenza batterica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una colonna di cromatografia ad esclusione dimensionale con resina a base di polisaccaridi.
- Eluizione della colonna con un tampone di equilibrazione.
- Caricamento del filtrato di coltura concentrato contenente EVs sulla colonna.
- Raccolta delle frazioni in base alla dimensione per analisi successive.
Risultati principali
- Le EV sono state separate con successo dalle proteine solubili utilizzando la SEC.
- Sono state raccolte frazioni contenenti EV per ulteriori studi.
- La metodologia ha dimostrato l'efficienza della SEC nella purificazione delle EV.
- Sono state ottenute informazioni sulla composizione delle EV attraverso l'analisi delle frazioni raccolte.
Conclusioni
- La cromatografia di esclusione molecolare è un metodo efficace per purificare le vescicole extracellulari provenienti da Mycobacterium tuberculosis.
- Lo studio migliora la comprensione del ruolo delle vescicole extracellulari nella patogenesi batterica.
- Le ricerche future potranno basarsi su questi risultati per esplorare applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La purificazione delle vescicole extracellulari (EV) di Mycobacterium tuberculosis mediante cromatografia di esclusione molecolare (SEC) risponde a un'esigenza fondamentale di preparazioni vescicolari ad alta purezza nella ricerca preclinica sulle malattie infettive. Questa tecnica consente un'isolazione affidabile delle EV per la caratterizzazione molecolare successiva, sostenendo studi meccanicistici e la validazione di bersagli nelle linee di ricerca sulle interazioni patogeno-ospite. La purificazione delle EV basata sulla SEC aumenta l'affidabilità predittiva nella ricerca traslazionale fornendo input standardizzati e riproducibili per saggi funzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'isolamento di EV intatti per lo studio delle vie di comunicazione batterica.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli fornendo popolazioni pure di vescicole per studi meccanicistici.
- Facilita la riduzione del rischio biologico minimizzando la contaminazione proteica nei preparati vescicolari.
- Migliora l'affidabilità predittiva dei saggi successivi che coinvolgono vescicole di origine patogena.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce frazioni standardizzate di EV per lo sviluppo e l'ottimizzazione di saggi.
- Garantisce la riproducibilità e la scalabilità dei flussi operativi di screening basati su vescicole.
- Consente una separazione quantitativa basata sulle dimensioni per supportare una valutazione affidabile dei composti.
- Permette il riutilizzo della piattaforma per la purificazione di vescicole provenienti da diverse ceppi batterici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le preparazioni di vescicole a modelli pertinenti alle malattie per studi traslazionali di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo EV di elevata qualità.
- Riduce il rischio nello sviluppo di bersagli basati su vescicole assicurando purezza e coerenza dei campioni.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica nei percorsi di ricerca sulle malattie infettive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La purificazione degli EV basata sulla SEC si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, fornendo input fondamentali per la validazione degli obiettivi, gli studi meccanicistici e lo sviluppo di saggi.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di vescicole con contaminanti minimi.
- Screening: Fornisce frazioni riproducibili e quantitative di vescicole extracellulari pronte per saggi e screening di composti.
- Analisi: Supporta analisi molecolari e funzionali a valle fornendo campioni di vescicole ben caratterizzati.
- Ricerca traslazionale: Collega gli studi sulle vescicole nella fase di scoperta alla validazione preclinica di biomarcatori e funzioni.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di purificazione riutilizzabile e adattabile a diversi sistemi batterici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi basati su vescicole.
- Valore operativo: Standardizza la purificazione degli EV per garantire riproducibilità e scalabilità tra i progetti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione garantendo input di alta qualità per saggi funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione adeguata ai rischi di bersagli e programmi correlati alle vescicole.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche cromatografiche e nella biologia delle vescicole.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per la cromatografia a esclusione dimensionale (SEC) e a infrastrutture per la raccolta delle frazioni.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di purificazione per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diverse ceppi batterici, tenendo conto dell'eterogeneità della dimensione delle vescicole.
- Limitato dalla necessità di una calibrazione accurata e di un monitoraggio costante delle prestazioni della colonna.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026