Una tecnica per quantificare l'infezione fungina nelle larve di pesce zebra

Prendi una larva di pesce zebra iniettata con spore fungine nel ventricolo rombencefalico.

I macrofagi vengono reclutati nel sito di iniezione, formando un ammasso stretto attorno alle spore.

Le spore subiscono l'inghiottimento fagocitario da parte dei macrofagi.

Queste spore hanno la capacità di resistere alla degradazione all'interno del fagosoma, permettendo loro di germogliare in ife e indurre la morte cellulare necrotica del macrofago.

Le ife possiedono modelli molecolari associati a patogeni esposti, o PAMP, sulla loro superficie.

I neutrofili reclutati nel sito di infezione, riconoscono e legano i PAMP. Il contatto con i neutrofili innesca un complesso fenotipo iper-ramificato nelle ife, ostacolando così il loro inghiottimento da parte dei neutrofili e facilitando l'evasione immunitaria.

Omogeneizzare la larva, rilasciando le spore fungine vitali e le ife. Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari e piastrare il surnatante su un terreno di coltura.

Al momento dell'incubazione, contare le unità formanti colonie fungine o CFU.

La conta delle CFU rappresenta il numero di spore fungine vitali che hanno eluso le difese immunitarie dell'ospite.

Immediatamente dopo l'iniezione, trasferire otto delle larve in singole provette da 1,7 millilitri e sopprimerle. Preparare 1 millilitro di PBS con ampicillina e kanamicina. Rimuovere quanto più liquido possibile dai tubi con le larve. Quindi, aggiungere 90 microlitri di PBS con antibiotici.

Omogeneizzare le larve in un lisatore di tessuti a 1.800 oscillazioni al minuto per 6 minuti. Quindi, girali verso il basso a 17.000 volte g per 30 secondi. Pipettare la sospensione omogeneizzata da ciascuna provetta al centro di una piastra GMM etichettata e stenderla utilizzando uno spandiconcime monouso a forma di L, facendo attenzione a evitare che si diffonda contro il bordo. Incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius per 2 o 3 giorni. Quindi, conta il numero di colonie formate.