JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:58 min • July 8th, 2025
Inizia con larve di pesce zebra transgenico che esprimono cellule immunitarie marcate con fluorescenza contrassegnate con marcatori fluorescenti unici per un tracciamento preciso.
Le larve sono pre-iniettate con una proteina fluorescente rossa che esprime spore di Aspergillus, nel loro rombencefalo.
All'interno del rombencefalo, le spore fungine imitano l'infiammazione locale e attirano le cellule immunitarie, compresi i macrofagi, che fagocitano le spore per la loro eliminazione.
Mentre alcune spore persistono e germinano in ife, rilasciando molecole derivate da agenti patogeni e attirando i neutrofili verso il sito di infezione.
Trasferire una larva anestetizzata nella camera di carico a medio contenuto del dispositivo di ferita e intrappolamento del pesce zebra per la crescita e l'imaging, o zWEDGI, dispositivo interconnesso alla camera di ferita tramite un canale di restrizione.
Fissare la larva all'interno del canale di restrizione con orientamento dorso-laterale per l'imaging del rombencefalo.
Nelle fasi iniziali, la fluorescenza rossa rappresenta le spore fungine, mentre la fluorescenza verde conferma il reclutamento dei macrofagi nel sito di infezione.
Nel tempo, la diffusione della fluorescenza rossa indica la progressione dell'infezione, mentre l'emergere di un'ulteriore fluorescenza blu indica il reclutamento dei neutrofili.
Il giorno dell'imaging, preparare una capsula di Petri da 3,5 millimetri con PTU 100 micromolari e una con E3-tricaina. Aggiungere la E3-tricaina nelle camere di un dispositivo zWEDGI e utilizzare una micropipetta P100 per rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal canale di contenimento, quindi rimuovere tutta la E3-tricaina in eccesso all'esterno delle camere.
Pipettare una larva e trasferirla nel piatto con la PTU E3, quindi trasferirla nella tricaina E3 con il minor liquido possibile. Dopo 30 secondi, trasferire le larve anestetizzate nella camera di carico del dispositivo di ferita e intrappolamento.
Rimuovere la E3-tricaina dalla camera di ferita e rilasciarla nella camera di carico per spostare la coda delle larve nel canale di restrizione. Assicurati che la larva sia posizionata sul lato laterale, dorsale o dorsolaterale in modo che il romboencefalo possa essere visualizzato con una lente dell'obiettivo invertita.
Dopo aver eseguito l'imaging della larva con un microscopio confocale, rilasciare E3-tricaina nella camera di ferita per spingere la larva dal canale di contenimento nella camera di carico. Raccogli la larva e trasferiscila nuovamente nel piatto con E3-tricaina, quindi trasferiscila nel piatto con E3 PTU con meno liquido possibile. Sciacquarlo in PTU e trasferirlo nuovamente nella piastra a 48 pozzetti.