Un test di aderenza all'opsono per valutare l'opsonizzazione dei batteri incapsulati da parte degli anticorpi anti-capsula

Prendi una sospensione di Bacillus anthracis ucciso chimicamente e marcato in modo fluorescente.

La capsula batterica, composta principalmente da acido poligamma-glutammico, fornisce protezione contro la fagocitosi.

Prendiamo i sieri di primati non umani, inattivati termicamente per distruggere le proteine del complemento. Questi sieri, isolati da animali immunizzati con un vaccino a base di capsule batteriche, contengono anticorpi anti-capsula.

Aggiungere la sospensione batterica chimicamente uccisa al siero. Gli anticorpi si legano specificamente alle capsule batteriche, facilitando l'opsonizzazione batterica e marcandole per l'eliminazione da parte delle cellule fagocitiche. Aggiungere proteine standard del complemento per migliorare l'opsonizzazione.

Trasferire i batteri opsonizzati ai macrofagi aderenti - cellule fagocitarie. Incubare brevemente.

Gli anticorpi e le proteine del complemento sui batteri si legano rispettivamente ai recettori Fc dei macrofagi e ai recettori del complemento, promuovendo l'aderenza batterica.

Rimuovi i supporti. Lavare con tampone per rimuovere i batteri non aderenti.

Fissare le cellule per preservare l'integrità cellulare.

Usa un colorante fluorescente per etichettare i macrofagi.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, osservare i batteri fluorescenti che aderiscono a macrofagi diversamente fluorescenti, confermando l'efficace opsonizzazione batterica da parte degli anticorpi anti-capsula.

Lavare tre volte il brodo batterico inattivato in PBS per rimuovere il fissativo. Aggiungere la soluzione FITC alla concentrazione finale di 75 microgrammi per millilitro. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a quattro gradi Celsius. Lavare i batteri come prima per rimuovere la FITC in eccesso.

Dopo il lavaggio finale, risospendere i bacilli in PBS allo stesso volume iniziale. Aliquotare e conservare i bacilli a -20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Inattivare a caldo un piccolo volume di sieri di prova di primati non umani a 56 gradi Celsius per 30 minuti, in un blocco termico o in una macchina per PCR. Scongelare e lavare i batteri marcati con FITC con PBS due volte pellettando a 15.000 volte g per tre-cinque minuti. Risospensione in PBS nello stesso volume iniziale.

In una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti, diluire in serie i sieri di prova in terreno cellulare. In un'altra piastra a fondo tondo da 96 pozzetti, aggiungere 10 microlitri di sieri di prova diluiti in ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 10 microlitri di complemento per coniglietti appena ricostituito.

Alla piastra numero tre, aggiungere il volume appropriato di bacilli marcati con FITC per una molteplicità di infezioni di 20, ad esempio, a un volume contenente 50.000 volte 20 bacilli per 50.000 cellule. Rabboccare ogni pozzetto nella piastra numero tre con il volume appropriato di terreno cellulare per un totale di 105 microlitri. Incubare la piastra numero tre a 37 gradi Celsius per 30 minuti in presenza del 5% di CO2 con umidità per opsonizzare i bacilli.

Posizionare la piastra numero uno, che contiene celle aderenti, su un blocco termico a 37 gradi Celsius. Utilizzare un pipettatore multicanale per rimuovere il terreno esaurito dai pozzetti e sostituirlo rapidamente con 100 microlitri di batteri opsonizzati dalla piastra numero tre, assicurandosi che non si generino bolle nei pozzetti durante il pipettaggio. Per non disturbare il monostrato cellulare, aggiungere volume ai lati dei pozzetti.

Incubare la piastra numero uno a 37 gradi Celsius con il 5% di CO₂ e umidità per 30 minuti per l'aderenza. Lavare ogni pozzetto cinque volte con 150 microlitri di PBS sopra un blocco termico a 37 gradi Celsius per rimuovere i bacilli non attaccati. Pipettare a lato dei pozzetti per assicurarsi che le cellule non si disperdano accidentalmente durante il lavaggio. Aggiungere 150 microlitri di paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto e fissare le cellule per un'ora.

Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS, mescolare due microlitri di colorante di cellule arancioni schermanti ad alto contenuto in 10 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 150 microlitri di questa soluzione colorante alle cellule fisse e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Posiziona la piastra numero uno sul tavolino e metti a fuoco le celle utilizzando il campo chiaro o il contrasto di fase.

Nella scheda Acquisizione, selezionare il formato a 96 pozzetti come impostazione della piastra, quindi selezionare Impostazioni canale. Quindi, seleziona Impostazione su Modalità piastrella. Indicare il numero di immagini da acquisire. Cambia la modalità di acquisizione in bianco e nero o monocromatico e imposta il binning su almeno 2 per 2. Attivare l'autofocus o il modulo di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica.

Quindi, attiva la funzione z-stack, se disponibile, indica il numero di z-stack che cattureranno lo spessore del monostrato cellulare e dei bacilli aderenti. Designare una cartella di file in cui salvare le immagini. Ora, esegui il programma di imaging automatizzato. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati, come descritto nel protocollo di testo.