Valutazione dell'attivazione controllata delle cellule T con un peptide MHC fotoattivabile

Inizia rivestendo un coprioggetto con poli-L-lisina biotinilata per creare una superficie ricca di biotina.

Successivamente, introduci la streptavidina, una proteina che si lega alla biotina, formando un ponte molecolare per le interazioni successive.

Successivamente, aggiungere peptidi biotinilati in gabbia fotogenica legati ai principali complessi di istocompatibilità, pMHC, insieme a molecole di adesione.

I ligandi biotinilati del pMHC e le molecole di adesione interagiscono con regioni specifiche della streptavidina, consentendone l'immobilizzazione.

Quindi, lavare ripetutamente il vetro coprioggetto con soluzione fisiologica tamponata e introdurre le cellule T.

La presenza di una fotogabbia, un gruppo chimico sensibile alla luce legato a un residuo specifico sul peptide, ostacola il legame spontaneo del recettore delle cellule T al peptide.

Per un'attivazione controllata delle cellule T, esporre i peptidi fotogabbiati alla luce ultravioletta.

La luce UV rompe il legame chimico tra il complesso fotogabbia-peptide, esponendo la forma nativa del peptide.

I recettori delle cellule T identificano e si attaccano ai peptidi esposti, mentre le integrine si legano alle molecole di adesione, innescando l'attivazione delle cellule T.

Iniziare aggiungendo poli-L-lisina biotinilata o bio-PLL diluita da 1 a 500 in acqua distillata deionizzata a 8 bicchieri di copertura a camera a 8 pozzetti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare con acqua distillata deionizzata, quindi asciugare per due ore a temperatura ambiente.

Bloccare le superfici rivestite in bio-PLL con tampone di blocco costituito da soluzione salina tamponata HEPES con il 2% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco dalle superfici rivestite di bio-PLL senza lasciare asciugare i pozzetti. Quindi, aggiungi la streptavidina e incuba a 4 gradi Celsius.

Dopo un'ora, lavare le superfici rivestite in HBS. Riempire e capovolgere i pozzetti dello scivolo della camera da 4 a 5 volte, rimuovendo l'HBS dai pozzetti. Non lasciare asciugare i pozzetti.

Aggiungere alle superfici rivestite di bio-PLL i ligandi del complesso principale di istocompatibilità del peptide biotinilato fotoattivabile specifico e le molecole di adesione per le cellule T CD4-positive o CD8-positive. Proteggere dalla luce e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare come prima e lasciare in HBS fino al momento della semina. Infine, aggiungere 200.000 cellule T CD4-positive o CD8-positive, esprimendo il TCR appropriato nei pozzetti corretti, e lasciare che le cellule aderiscano a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Una volta che le cellule si sono attaccate e diffuse sulla superficie, sono pronte per la fotoattivazione e l'imaging. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertito dotato di un obiettivo 150x compatibile con i raggi UV. Monitora le sonde in entrambi i canali verde e rosso utilizzando laser di eccitazione rispettivamente a 488 nanometri e 561 nanometri.

Dopo aver montato il vetrino della camera contenente le cellule T, regolare le impostazioni del microscopio per ottenere l'illuminazione TIRF o a epifluorescenza, se necessario. In modalità live, selezionare un campo di celle che esprimono le sonde fluorescenti di interesse. Stabilisci regioni su scala micron per la fotoattivazione sotto le singole cellule utilizzando il controllo software. Quindi, inizia l'acquisizione.

In genere, vengono acquisiti 80 punti temporali con un intervallo di 5 secondi tra ciascuno. Ciò lascia il tempo per esposizioni sequenziali a 488 nanometri e 563 nanometri nel caso di esperimenti a due colori. Quindi, dopo aver acquisito 10 punti temporali, fotoattivare le regioni selezionate aprendo l'otturatore digitale a diaframma per 1-1,5 secondi. Al termine del time-lapse, selezionare un nuovo campo di celle e ripetere il processo.