Un test di immunofluorescenza per caratterizzare e quantificare i granuli di stress dei mammiferi

Prelevare una piastra multipozzetto contenente cellule aderenti all'osteosarcoma sui vetrini.

Queste cellule tumorali ossee sono pretrattate con una sostanza chimica che induce stress, con conseguente formazione di granuli di stress.

I granuli di stress sono organelli citoplasmatici privi di membrana che comprendono mRNA non traducibili, piccole subunità ribosomiali, proteine leganti l'RNA o RBP, fattori correlati alla traduzione e proteine di segnalazione.

Eliminare il terreno e lavare le celle con il tampone. Fissare le cellule per preservare la morfologia cellulare.

Permeabilizzare le cellule per accedere a bersagli intracellulari. Aggiungere proteine bloccanti per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Introdurre anticorpi primari che si legano a specifici RBP e fattori correlati alla traduzione all'interno dei granuli di stress.

Incubare con diversi anticorpi secondari marcati con fluoroforo e colorante Hoechst.

Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari legati alle proteine associate ai granuli di stress, mentre le molecole di Hoechst colorano il DNA.

Montare i vetrini coprioggetti contenenti le celle utilizzando i supporti di montaggio.

Utilizzando un