Un test di immunofluorescenza per caratterizzare e quantificare i granuli di stress dei mammiferi

Prelevare una piastra multipozzetto contenente cellule aderenti all'osteosarcoma sui vetrini.

Queste cellule tumorali ossee sono pretrattate con una sostanza chimica che induce stress, con conseguente formazione di granuli di stress.

I granuli di stress sono organelli citoplasmatici privi di membrana che comprendono mRNA non traducibili, piccole subunità ribosomiali, proteine leganti l'RNA o RBP, fattori correlati alla traduzione e proteine di segnalazione.

Eliminare il terreno e lavare le celle con il tampone. Fissare le cellule per preservare la morfologia cellulare.

Permeabilizzare le cellule per accedere a bersagli intracellulari. Aggiungere proteine bloccanti per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Introdurre anticorpi primari che si legano a specifici RBP e fattori correlati alla traduzione all'interno dei granuli di stress.

Incubare con diversi anticorpi secondari marcati con fluoroforo e colorante Hoechst.

Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari legati alle proteine associate ai granuli di stress, mentre le molecole di Hoechst colorano il DNA.

Montare i vetrini coprioggetti contenenti le celle utilizzando i supporti di montaggio.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, osservare le cellule per visualizzare e quantificare i granuli di stress, che appaiono come focolai fluorescenti caratterizzati dalla co-localizzazione delle proteine associate.

Per fissare le cellule, rimuovere il terreno dai pozzetti e lavare le cellule con circa 250 microlitri di PBS. Aggiungere circa 250 microlitri di una soluzione tamponata di paraformaldeide al 4% per fissare le cellule, assicurandosi che la parte superiore del vetrino coprioggetti sia completamente coperta. Quindi, lasciare la piastra su un bilanciere da banco a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, rimuovere e scartare correttamente la paraformaldeide.

Aggiungere circa 250 microlitri di metanolo ghiacciato per permeabilizzare e appiattire le cellule. Incubare la piastra per altri 5 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere. Una volta completata la permeabilizzazione, scartare il metanolo e bloccare le cellule applicando circa 250 microlitri di tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, preparare la soluzione di anticorpi primari aggiungendo 12 microlitri di anticorpi contro G3BP1, eIF4G ed eIF3b a 3 millilitri di tampone bloccante.

Aggiungere 250 microlitri della soluzione anticorpale a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Incubare la piastra su un bilanciere per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare le cellule con circa 250 microlitri di PBS per 5 minuti. Successivamente, aggiungere 12 microlitri di anticorpi anti-topo Cy2, anti-coniglio Cy3 e anti-capra Cy5 insieme a 3 microlitri di colorante Hoechst a 3 millilitri di tampone bloccante per preparare la soluzione anticorpale secondaria.

Aggiungere 250 microlitri della soluzione di anticorpi secondari a ciascun pozzetto e coprire la piastra per proteggere i campioni dalla luce. Incubare la piastra su un bilanciere a temperatura ambiente per 1 ora. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare le cellule con PBS per 5 minuti. Riscaldare il mezzo di montaggio nel blocco termico a 37 gradi Celsius per 10 minuti per ridurre la viscosità. Quindi, utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri pretagliato, posizionare 25 microlitri del mezzo di montaggio su un vetrino etichettato.

Con una pinza fine, trasferire il vetrino coprioggetti dal pozzetto al vetrino, capovolgendo la parte superiore in modo che le cellule siano rivolte verso il mezzo di montaggio. Utilizzare una punta P200 pulita per premere il vetrino coprioggetti verso il basso. Una volta montati tutti i vetrini coprioggetti, rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso premendo saldamente un fazzoletto da laboratorio contro il vetrino. Successivamente, sciacquare il vetrino con acqua e tamponarlo immediatamente con del tessuto di laboratorio.