JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:55 min • July 8th, 2025
Scongelare le carte da filtro contenenti il liquido di rivestimento della mucosa nasale assorbito sul ghiaccio per evitare la degradazione del campione.
Il fluido comprende mediatori immunitari, tra cui chemochine e citochine.
Immergere le carte da filtro in un tampone. Trasferire il contenuto nei filtri tubolari. Centrifugare per eluire il fluido di rivestimento della mucosa dalla carta da filtro.
Aggiungere l'estratto nasale filtrato alla piastra del saggio modellata con una serie di anticorpi di cattura specifici per il mediatore.
I mediatori immunitari si legano agli anticorpi corrispondenti.
Introdurre anticorpi di rilevamento marcati con un complesso di rutenio, che si legano ai rispettivi mediatori.
Aggiungere un tampone a base di tris contenente tripropilammina o TPA.
Quando un potenziale viene applicato attraverso gli elettrodi, il complesso rutenio e il TPA subiscono ossidazione.
Il radicale TPA risultante eccita il complesso del rutenio.
Al ritorno al suo stato fondamentale, il complesso del rutenio emette fotoni.
L'intensità della luce misurata è proporzionale alla concentrazione specifica di mediatore immunitario nel fluido di rivestimento della mucosa.
Per la quantificazione del mediatore immunitario delle vie aeree, posizionare sul ghiaccio fino a 10 campioni provenienti da una temperatura negativa di 80 gradi Celsius e registrare i relativi numeri di identificazione. Quando i campioni si sono scongelati, immergere entrambe le carte da filtro per soggetto in 150 microlitri di tampone appena preparato per carta da filtro.
Integrarlo con una compressa completa di inibitore della proteasi per 25 millilitri di soluzione tampone. Trasferire i campioni in un agitatore a piastre a 400 giri/min per 5 minuti. Trasferire il tampone e la carta da filtro nelle tazze dei singoli filtri in tubo di acetato di cellulosa.
Centrifugare i campioni per raccogliere l'estratto nasale filtrato sul fondo delle provette per microcentrifuga. Quindi, rimuovere le coppette e posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, trasferire aliquote da 150 microlitri di estratto nasale in pozzetti individuali di piastre di conservazione a basso legame proteico e conservare le piastre a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'analisi. Quindi, misurare la concentrazione dei mediatori immunitari nasali di interesse mediante array multiplex basato su elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità, secondo i protocolli di analisi standard.