Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:42 min. • July 8th, 2025
I virus avvolti con proteine spike transmembrana contengono un sito di scissione proteolitico.
Le proteasi legate alla membrana sulle cellule ospiti scindono le proteine spike, esponendo peptidi di fusione che facilitano l'ingresso del virus.
Per iniziare, prendi i peptidi wild-type con il sito di scissione canonico e i peptidi varianti, ciascuno con una mutazione unica nel sito.
I peptidi fluorogenici contengono un fluoroforo e un quencher. A causa della prossimità, il quencher assorbe la fluorescenza del fluoroforo.
Prelevare una piastra a più pozzetti su ghiaccio, contenente tampone di saggio e proteasi dell'ospite.
Aggiungere i peptidi wild-type e varianti in pozzetti separati. Incubare a una temperatura appropriata per un'attività ottimale della proteasi.
La proteasi scinde i peptidi, separando il quencher dal fluoroforo e consentendone l'emissione di fluorescenza.
Misurare la variazione del segnale di fluorescenza per determinare il tasso di scissione proteolitica.
Un tasso più alto per la sequenza wild-type indica una maggiore attività proteolitica, mentre un tasso più basso per le varianti indica un'alterata efficienza di scissione.
Preparare i tamponi di dosaggio appropria
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