Un test per quantificare la fagocitosi mediata da anticorpi di eritrociti infetti da parassiti

Prendi gli eritrociti infetti da Plasmodium falciparum. Etichettare il DNA del parassita con un colorante fluorescente per la visualizzazione del parassita.

Incubare questi eritrociti infetti da parassiti con sieri di individui esposti alla malaria. Queste cellule mostrano antigeni parassiti sulla loro superficie, che si attaccano agli anticorpi IgG umani acquisiti naturalmente nei sieri, opsonizzando le cellule per la fagocitosi.

Trasferire gli eritrociti infettati da parassiti opsonizzati in una piastra multipozzetto rivestita di proteine contenente una sospensione di monociti di derivazione umana o cellule fagocitiche.

Durante l'incubazione, i recettori Fc-gamma sui monociti interagiscono con gli eritrociti opsonizzati IgG, innescando l'inghiottimento degli eritrociti nei fagosomi.

Dopo l'incubazione, centrifugare la piastra per prevenire ulteriori interazioni cellulari e fermare la fagocitosi.

Scartare il surnatante. Trattare con soluzione licante di cloruro di ammonio, rompendo selettivamente gli eritrociti infetti non fagocitati senza intaccare i monociti.

Aggiungere un tampone contenente siero per arrestare il processo di lisi. Centrifugare ed eliminare il surnatante contenente eritrociti lisati.

Risospendere i monociti in un tampone.

Eseguire la citometria a flusso per quantificare i monociti che mostrano fluorescenza dagli eritrociti infetti dal parassita al loro interno, confermando la loro fagocitosi mediata da anticorpi.

Regolare la sospensione di eritrociti infetti purificati di 3,3 volte 10 alla settima cellula per millilitro in terreno di coltura parassita contenente bromuro di etidio a una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro. Quindi, rimuovere la soluzione bloccante da una piastra a 96 pozzetti inserendo la piastra in un contenitore per rifiuti. Quindi, rimuovere l'eccesso su un tovagliolo di carta e aggiungere 30 microlitri di sospensione di eritrociti infetta con etichetta al bromuro di etidio a tutti i pozzetti tranne uno nella metà superiore della piastra. Aggiungere 30 microlitri di terreno di coltura antiparassitaria al pozzetto vuoto e incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 170 microlitri di terreno di coltura dei parassiti a ciascun pozzetto e sedimentare gli eritrociti infetti sul fondo della piastra mediante centrifugazione. Rimuovere il surnatante inserendo la piastra in un contenitore per rifiuti e lavare gli eritrociti infetti marcati con bromuro di etidio altre due volte con 200 microlitri di terreno di coltura parassitaria per pozzetto, come appena dimostrato.

Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere con cura l'intero volume di surnatante da ciascun pozzetto, senza disturbare i pellet, e risospendere gli eritrociti infetti marcati con bromuro di etidio in 30 microlitri di soluzione anticorpale, compresi i controlli appropriati e i campioni di prova precedentemente preparati in terreno di coltura antiparassita. Quindi, posizionare il piatto a 37 gradi Celsius per 45 minuti, al riparo dalla luce.

Mentre gli eritrociti infetti vengono opsonizzati, raccogliere le cellule THP-1 mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 12 millilitri di terreno di coltura cellulare THP-1 fresco e preriscaldato.

Dopo una seconda centrifugazione, risospendere il pellet in 1 millilitro di terreno di coltura cellulare THP-1 per il conteggio e regolare la concentrazione cellulare a 5 volte 10-5 cellule per millilitro nel terreno di coltura cellulare THP-1. Rimuovere la soluzione bloccante dalla seconda piastra a 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di cellule THP-1 a ciascun pozzetto. Quindi, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari.

Al termine dell'incubazione dell'opsonizzazione, aggiungere 170 microlitri di terreno di coltura dei parassiti a ciascun pozzetto della piastra di opsonizzazione e sedimentare gli eritrociti infetti sul fondo della piastra mediante centrifugazione. Lavare gli eritrociti opsonizzati e infetti due volte con 200 microlitri di terreno di coltura antiparassitaria per pozzetto utilizzando una pipetta multicanale per rimuovere con cura il surnatante dopo il secondo lavaggio.

Risospendere gli eritrociti infetti opsonizzati in 100 microlitri di terreno di coltura cellulare THP-1 preriscaldato per pozzetto e trasferire 50 microlitri di ciascuna sospensione di eritrociti infetti opsonizzati in un pozzetto corrispondente nella piastra di fagocitosi. Quando tutte le cellule sono state aggiunte, porre la piastra nell'incubatore per colture cellulari per non più di 40 minuti, al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione, interrompere la fagocitosi mediante centrifugazione a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet con 150 microlitri di soluzione lisanti di cloruro di ammonio a temperatura ambiente per pozzetto. Dopo tre minuti esatti, aggiungere 100 microlitri di FBS ghiacciato al 2% in PBS per fermare la lisi e sedimentare le cellule intatte mediante centrifugazione.

Successivamente, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di FBS fresco ghiacciato al 2% in PBS, per pozzetto, per lavaggio. Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di FBS fresco ghiacciato al 2% in PBS per pozzetto.

Per l'acquisizione e l'analisi della citometria a flusso, caricare immediatamente le cellule su un citometro a flusso e utilizzare il grafico di dispersione lineare in avanti rispetto a quello laterale lineare per i pozzetti senza eritrociti infetti per il gate delle cellule THP-1. Acquisisci 10.000 eventi in questo cancello e usa le cellule THP-1 con gli eritrociti infetti opsonizzati con un controllo positivo per impostare un grafico a istogramma per misurare l'intensità della fluorescenza del bromuro di etidio.

Per l'analisi, aprire il grafico di dispersione lineare in avanti rispetto a quello lineare per i pozzetti senza eritrociti infetti e bloccare le cellule THP-1. Quindi, impostare un gate positivo in un istogramma FL3 e copiare questi gate su tutti gli altri pozzetti del campione per determinare la percentuale di cellule THP-1 positive al bromuro di etidio.