Un test in vitro per misurare l'attività della proteasi della serina neutrofila utilizzando un reporter fluorescente
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Prelevare una micropiastra contenente neutrofili serina proteasi o NSP. Questi enzimi solubili con attività proteolitica, secreti dai neutrofili, funzionano nelle risposte infiammatorie.
Aggiungete sonde reporter fluorescenti con un motivo di riconoscimento che funge da sito di scissione per gli NSP. Le sonde sono coniugate a un fluoroforo donatore e a un fluoroforo accettore.
Dopo l'eccitazione di una specifica lunghezza d'onda, il fluoroforo donatore emette energia. A causa della sua vicinanza al donatore, il fluoroforo accettore assorbe l'energia ed emette fluorescenza di una diversa lunghezza d'onda.
Rileva i segnali del donatore e dell'accettore separatamente e calcola il rapporto donatore/accettore per valutare l'attività dell'NSP. Un rapporto basso indica l'estinzione della fluorescenza del donatore in assenza di scissione della sonda.
Gli NSP riconoscono e tagliano il motivo di riconoscimento sulle sonde, rilasciando l'accettore.
La distanza dall'accettore consente l'emissione di fluorescenza dal fluoroforo donatore, aumentando il rapporto donatore-accettore. Un rapporto elevato indica un'efficiente scissione della sonda da parte degli NSP.
Scongelare gli enzimi sul ghiacci
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