JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Prelevare una micropiastra contenente neutrofili serina proteasi o NSP. Questi enzimi solubili con attività proteolitica, secreti dai neutrofili, funzionano nelle risposte infiammatorie.
Aggiungete sonde reporter fluorescenti con un motivo di riconoscimento che funge da sito di scissione per gli NSP. Le sonde sono coniugate a un fluoroforo donatore e a un fluoroforo accettore.
Dopo l'eccitazione di una specifica lunghezza d'onda, il fluoroforo donatore emette energia. A causa della sua vicinanza al donatore, il fluoroforo accettore assorbe l'energia ed emette fluorescenza di una diversa lunghezza d'onda.
Rileva i segnali del donatore e dell'accettore separatamente e calcola il rapporto donatore/accettore per valutare l'attività dell'NSP. Un rapporto basso indica l'estinzione della fluorescenza del donatore in assenza di scissione della sonda.
Gli NSP riconoscono e tagliano il motivo di riconoscimento sulle sonde, rilasciando l'accettore.
La distanza dall'accettore consente l'emissione di fluorescenza dal fluoroforo donatore, aumentando il rapporto donatore-accettore. Un rapporto elevato indica un'efficiente scissione della sonda da parte degli NSP.
Scongelare gli enzimi sul ghiaccio e impostare una curva standard enzimatica come descritto nel manoscritto del testo. Parallelamente alla preparazione standard, diluire i campioni di espettorato nel tampone di attivazione. Sul lettore di piastre, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione per la sonda NE FRET NEmo-1 a 354 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 400 nanometri per il donatore e 490 nanometri per l'accettore.
Per la sonda CG FRET sSAM, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 405 nanometri e l'emissione a 485 nanometri per il donatore e 580 nanometri per l'accettore. Aggiungere 40 microlitri di campioni, standard o spazi vuoti nei pozzetti di una piastra nera a 96 pozzetti a mezza area e aggiungere la miscela master.
Avviare il lettore di piastre e registrare l'aumento del rapporto donatore-accettore ogni 60-90 secondi per almeno 20 minuti o fino a quando l'aumento del segnale non raggiunge un plateau. Esporta i dati e calcola il rapporto donatore/accettore dividendo la RFU del donatore per la RFU accettore per ogni punto temporale e campione. Quindi, calcola la media del rapporto donatore/accettore e la deviazione standard. Determinare la pendenza all'interno della crescita lineare della variazione del rapporto donatore-accettore.