Un metodo basato su chip microfluidico per l'analisi rapida della chemiotassi dei neutrofili utilizzando sangue intero

A un campione di sangue intero, aggiungere complessi anticorpali specifici diretti contro le cellule del sangue, ad eccezione dei neutrofili.

Aggiungere particelle magnetiche che si legano alle cellule del sangue legate al complesso anticorpale.

Trasferire il campione marcato immunomagneticamente alla porta di caricamento cellulare di un chip microfluidico.

Collegare i dischi magnetici alla porta di caricamento delle celle.

Il campo magnetico attrae le cellule marcate immunomagneticamente, intrappolandole sulle pareti laterali della porta.

I neutrofili, non essendo marcati, fluiscono nel chip e rimangono intrappolati nell'area di aggancio delle cellule.

Aggiungere una soluzione chemioattrattiva marcata con fluorescenza e il mezzo di migrazione ai serbatoi designati. I liquidi scorrono attraverso i canali microfluidici, formando un gradiente di concentrazione.

Quando il chemioattrattivo si lega al recettore dei neutrofili, innesca cambiamenti intracellulari, inducendo i neutrofili a riorganizzare il loro citoscheletro ed estendere gli pseudopodi.

Questi pseudopodi agiscono come piedi, spingendo i neutrofili verso concentrazioni di chemioattrattivi più elevate, un processo chiamato chemiotassi.

Utilizzare tecniche di microscopia appropriate per monitorare la migrazione dei neutrofili in risposta al gradiente chemioattrattivo.

Rimuovere l'acqua deionizzata dal dispositivo e aggiungere 100 microlitri di soluzione di fibronectina dalla presa. Attendere tre minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con la soluzione di Fibronectina. Quindi, incubare il dispositivo in una capsula di Petri coperta per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere la soluzione di fibronectina dal dispositivo e aggiungere 100 microlitri di terreno di migrazione dalla presa. Anche in questo caso, attendere tre minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con il mezzo di migrazione. Incubare il dispositivo per un'altra ora a temperatura ambiente, prima di utilizzare il dispositivo nell'esperimento di chemiotassi. Mettere 10 microlitri di sangue intero in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 2 microlitri del cocktail di anticorpi in due microlitri di particelle magnetiche da un kit di isolamento dei neutrofili e mescolare delicatamente la provetta per marcare magneticamente le cellule marcate con anticorpi. Incubare la miscela dell'etichetta per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, collegare due piccoli dischi magnetici ai due lati della porta di caricamento della cella del dispositivo. Aspirare il fluido da tutte le porte del dispositivo. Quindi, pipettare lentamente due microlitri della miscela di sangue marcata nel dispositivo microfluidico dalla porta di caricamento delle cellule. Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio a temperatura controllata a 37 gradi Celsius. Attendere qualche minuto fino a quando un numero sufficiente di neutrofili è intrappolato nell'area di aggancio delle cellule.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione chemioattrattiva in 100 microlitri di terreno di migrazione ai serbatoi di ingresso designati, utilizzando due pipettatori. Questo genererà un gradiente chemioattrattivo mediante miscelazione chimica continua basata sul flusso laminare. Il chemioattrattivo può essere costituito da proteine ricombinanti, come l'FMLP, o da campioni clinici, come il surnatante dell'espettorato di pazienti con BPCO.

Una volta che il flusso si è stabilizzato, acquisire immagini a fluorescenza del gradiente di destrano FITC nel canale. Quindi, incubare il dispositivo sul tavolino del microscopio a temperatura controllata o in un incubatore per colture cellulari convenzionale per 15 minuti. Dopo l'incubazione, visualizzare il canale del gradiente, utilizzando un obiettivo 10 volte per registrare le posizioni finali della cellula per l'analisi dei dati.