JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:04 min • July 8th, 2025
Prendiamo due popolazioni di cellule T CD8+: le cellule T effettrici CD8+ pre-attivate attraverso l'impegno mediato da anticorpi delle cellule T e dei recettori co-stimolatori e le cellule T CD8+ soppresse inibite dalle cellule soppresse di derivazione mieloide.
Aggiungere queste cellule T a pozzetti rivestiti di membrana basale con cellule tumorali che esprimono una proteina fluorescente a restrizione nucleare.
Pipettare un substrato fluorogenico della caspasi-3, un colorante fluorogenico legante il DNA coniugato a un peptide contenente il sito di riconoscimento della caspasi-3.
incubare. I recettori delle cellule T effettrici si legano al complesso MHC-peptide di classe I sulle cellule tumorali, innescando il rilascio di granuli citotossici contenenti perforine e granzimi.
Le perforine creano i pori della membrana delle cellule tumorali, consentendo l'ingresso dei granzimi e l'attivazione delle caspasi, avviando l'apoptosi.
Le caspasi attivate fendono inoltre il substrato della caspasi fluorogenica, rilasciando il colorante che si lega al DNA e diventa fluorescente.
Al microscopio a fluorescenza, le cellule tumorali co-coltivate con cellule T effettrici mostrano una doppia fluorescenza nucleare, che indica l'apoptosi delle cellule tumorali.
Al contrario, le cellule tumorali co-coltivate con cellule T soppresse mostrano solo la fluorescenza delle proteine nucleari, suggerendo cellule non apoptotiche.
Per impostare una co-coltura di cellule bersaglio di cellule T CD8-positive preattivate, aggiungere innanzitutto 30 microlitri di matrice di membrana basale solubile diluita con fattore di crescita ridotto da 1 a 100 ai pozzetti appropriati di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti adatta alla microscopia. Agitare la piastra per distribuire uniformemente la matrice e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per almeno un'ora. Mentre la piastra è in equilibrio, preparare le cellule bersaglio. Aspirare il terreno, lavare con PBS e aggiungere 1 millilitro di tripsina-EDTA allo 0,05% a temperatura ambiente per 1 minuto.
Aggiungere 9 millilitri di DMEM integrato con siero fetale bovino mediante pipettaggio delicato e trasferire le cellule dissociate in provette. Dopo aver centrifugato le celle, risospendere il pellet in 500 microlitri di EDMEM. Filtrare le cellule risospese attraverso un colino cellulare e contare le cellule vive. Quindi, regolare la densità a 4 volte 10 per le quarte cellule bersaglio per millilitro in EDMEM fresco su ghiaccio.
Successivamente, pipettare alcune volte le cellule T CD8-positive preattivate per risospendere le cellule in una sospensione a cellula singola e trasferire le cellule T galleggianti in una provetta da 1,5 millilitri per condizione. Raccogliere le cellule rimanenti con 200 microlitri di PBS per pozzetto, trasferire i lavaggi nelle apposite provette da 1,5 millilitri e centrifugare. Aspirare il terreno e aggiungere 1 millilitro di EDMEM a ciascuna provetta per la centrifugazione.
Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet in 100 microlitri di EDMEM fresco per provetta. Dopo il conteggio, regolare le cellule in ciascuna provetta a una densità di 1,6 volte 10 al quinto linfociti T CD8-positivi pre-attivati per millilitro di terreno e posizionare le cellule sul ghiaccio. Quando le cellule sono pronte, aspirare la matrice della membrana basale da ciascun pozzetto della piastra per microscopia a 96 pozzetti e aggiungere 50 microlitri di cellule bersaglio ai singoli pozzetti all'interno dei 60 pozzetti interni della piastra con miscelazione.
Aggiungere 25 microlitri di EDMEM integrato con 4 volte 10 alla terza unità per millilitro di IL-2 e 10 micromolari di substrato di caspasi-3 fluorogenica nei pozzetti appropriati. Quindi, aggiungere 25 microlitri di cellule T CD8-positive preattivate ai pozzetti appropriati e, infine, aggiungere EDMEM ai pozzetti appropriati per ottenere un volume totale fino a 100 microlitri. Aggiungere 200 microlitri di PBS o acqua sterile in tutti i pozzetti vuoti, agitare la piastra e lasciare la piastra su una superficie piana per 10 minuti.
Per visualizzare le cellule, impostare il microscopio in modo da acquisire immagini a contrasto di fase, nonché canali fluorescenti adatti alla proteina fluorescente a restrizione nucleare e i fluorofori del substrato della caspasi-3 attivata fluorogenica utilizzati nell'esperimento. Quindi, acquisire immagini di ciascun pozzetto sperimentale in contrasto di fase e dei due canali fluorescenti ogni una o tre ore per almeno 72 ore.