Un test multiplex basato su perline per l'analisi delle citochine in campioni di lacrima umana

Aggiungere campioni di lacrime umane e un cocktail di perline di anticorpi in una piastra di analisi lavata.

Gli anticorpi sono legati a microsfere magnetiche codificate a colori, impregnate con proporzioni variabili di fluorofori corrispondenti a firme spettrali distinte, facilitando il rilevamento di più citochine.

Le citochine lacrimali si legano ai corrispondenti anticorpi di cattura legati alle perline.

Utilizzando una rondella magnetica per piastre, depositare i complessi anticorpo-perlina. Utilizzando il tampone, rimuovere le biomolecole non legate.

Aggiungere anticorpi di rilevamento biotinilati che si legano alle citochine legate.

Pipetta coniugato streptavidina-ficoeritrina, che si lega agli anticorpi biotinilati.

Utilizzando la rondella per piastre, rimuovere il contenuto del pozzetto non legato. Risospendere i complessi legati alle citochine nel fluido della guaina.

Durante l'analisi del campione, il sistema fluidico trasporta i complessi di perline al gruppo ottico.

Il primo laser attiva i coloranti interni delle microsfere, con il segnale risultante che identifica specifiche citochine.

Il secondo laser attiva la molecola reporter legata al complesso di perline, la cui intensità del segnale rappresenta la concentrazione di citochine, consentendo la quantificazione simultanea di più citochine.

Per eseguire il test multiplex basato su microsfere, portare tutti i reagenti a temperatura ambiente e farli vorticare per cinque-10 secondi. Se i campioni di lacrime eluiti sono stati conservati a meno 80 gradi Celsius prima del test, scongelare gli estratti di lacrime congelati su ghiaccio e centrifugare i campioni a 1.000 volte g per cinque minuti. Preparare un foglio di lavoro del saggio in una configurazione verticale per gli standard di citochine umane QC-1, QC-2 e campioni funzionanti.

Aggiungere 200 microlitri di 1x tampone di lavaggio a ciascun pozzetto della piastra e sigillarlo con un sigillante per piastre. Quindi, incubare la piastra su uno shaker a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, decantare il tampone di lavaggio 1x capovolgendo la piastra e picchiettarlo più volte sugli asciugamani assorbenti per rimuovere la quantità residua di tampone di lavaggio nei pozzetti.

Quindi, aggiungere 25 microlitri di ciascuna citochina umana standard funzionante QC-1, QC-2 e il bianco con solo il tampone di analisi e i campioni nei pozzetti appropriati. Aggiungere 25 microlitri di tampone per il saggio in ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 25 microlitri di 1x soluzione cocktail di perline di anticorpi.

Poiché la soluzione del microscotto dell'anticorpo è sensibile alla luce, sigillare la piastra e coprirla con un foglio di alluminio e un coperchio della piastra per proteggerla dalla luce durante il saggio. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius su uno shaker per una notte. Il giorno seguente, posizionare la piastra sulla griglia di una lavapiatti magnetica automatica e lasciarla riposare per un minuto per depositare le perle magnetiche sul fondo del pozzetto.

Aspirare il contenuto del pozzetto e aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto utilizzando il lavapiatti magnetico automatico. Lasciare riposare la piastra per un minuto, quindi aspirare il contenuto del pozzetto come prima e ripetere il lavaggio ancora una volta. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpi di rilevamento in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra, coprirla con un foglio di alluminio e copripiastra e incubare a temperatura ambiente su uno shaker per 60 minuti. Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di streptavidina-ficoeritrina in ciascun pozzetto e, dopo aver sigillato e coperto la piastra, incubare a temperatura ambiente su uno shaker per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, posizionare la piastra su una rondella magnetica e lasciarla riposare per un minuto. Quindi, aspirare il contenuto del pozzetto e aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto. Lasciare riposare per un minuto, quindi aspirare il contenuto del pozzetto prima di ripetere nuovamente il lavaggio. Aggiungere 150 microlitri di liquido di guaina in ogni pozzetto. Quindi, posizionare la piastra su uno shaker per cinque minuti a temperatura ambiente per risospendere le perle di anticorpi prima di procedere alla lettura della piastra e all'analisi delle concentrazioni di citochine.